1. 研究目的与意义
类胡萝卜素是一类在植物动物和微生物中广泛存在的脂溶性色素，已被广泛地应用于药物，保健品，动物饲料和化妆品的生产。它们不仅可以作为维生素 C 源，还可以有效地保护细胞中的各种生物大分子不受自由基的损伤，从而维持细胞正常的生理代谢，防止衰老和癌变。海洋红酵母因其含有丰富的类胡萝卜素不饱和脂肪酸等，现在已经作为一种益生菌应用于海产品养殖，它既可以作为鱼类的饵料为其提供各种营养物质和类胡萝卜素，又可以附着在鱼鳞上防止其他有害细菌的滋生，提高鱼类的存活率，红酵母既可以作为有益微生物与海洋生物共生，又可以作为菌体蛋白应用于功能饲料的开发。随着畜牧业和饲料业的迅猛发展，饲料添加剂也向着广度和深度方向发展。现在很多国家和地区都在加大对饲料添加剂的研发，其中美国日本和欧盟等已有多种饲料添加剂产品，随着饲料添加剂的运用，其在养殖业中的作用越来越显著。从目前来看，随着人们对合成色素毒性的认识程度的加深，许多国家已禁止使用毒性较大的化学合成色素，转为使用天然的微生物、植物和动物产品。受资源和环境等条件的限制，天然动植物增色饲料添加剂的发展空间受到制约。利用微生物发酵法生产增色饲料添加剂将是发展的必然趋势。增色饲料添加剂的研究与应用已取得初步进展，本论文从筛选高产类胡萝卜素的菌种出发，选育出一株类胡萝卜素产量远高于市售海洋红酵母的锁掷酵母，对其发酵条件进行优化选择，并根据新食品原料安全性要求进行一部分毒理学实验。
2. 文献综述
红酵母（锁掷酵母）发酵条件优化和安全毒理学研究
吴树晴
摘要：锁掷酵母的基本情况介绍和主要的营养成分含量说明，研究了不同碳源、温度、PH、有机氮源、溶氧等条件来对其类胡萝卜素生成的影响，从而选择最优条件。通过对比其他酵母类安全毒理学评价实验和国标要求，拟定了实验方案和试验样品。
关键词：锁掷酵母；发酵条件；安全
1.锁掷酵母简介
江南大学生物工程学院氨基酸研究所张伟国教授，从自然界中筛选到一株红酵母，通过ITS序列鉴定该酵母为Sporidiobolus pararoseus（锁掷酵母属菌株），与Sporobolomyces（掷孢酵母属）和Rhodotorula（红酵母属菌株）亲缘关系十分近。
1.1锁掷酵母菌种形态
1.2锁掷酵母作为功能性饲料的可行性分析
随着畜禽和海产品养殖技术的进步，饲养周期明显缩短。但是在动物对色素的利用上表现为产品中色素自然沉积下降，达不到自然生长下的色泽，从而不能满足消费者对色泽的要求。消费者往往将人工集约饲养的畜禽及水产品的色泽与传统方式养殖或自然状态下存在的产品色泽进行比较，突出强调蛋黄和禽的脚胫、皮肤、腹脂是否达到金黄色或橙红色，水产品是否是野生的自然色泽。人们习惯上以此判断畜禽、水产品的营养价值，质量和风味。因此外观在一定程度上决定了它们的价值水平。经过分析这些呈色物质是类胡萝卜素在不同组织中逐渐沉积而成的，但是动物自身不能合成这些色素，因此必须从食物中摄取。
科学家们发现天然色素的作用不仅赋予畜禽及水产品美丽的色彩，而且具有清除自由基，提高动物免疫力，提高马、牛、猪等繁殖能力和生长的作用。类胡萝卜素不仅可以从外观上提高畜禽和海产品的认可度，还可以从根本上提高其质量。随着对类胡萝卜素的研究不断深入，科学家一致认为类胡萝卜素对畜禽和海产品的益处可以通过食物链传递下去。
畜禽和水产品的色泽与传统方式养殖的产品色泽的差异主要在于养殖时间的
缩短动物体内类胡萝卜素富集量达不到要求。因此可以通过增加饲料中类胡萝卜
素的富含量来提高畜禽和海产品中的类胡萝卜素的含量。
1.3锁掷酵母中营养成分分析
锁掷酵母是良好的饲料酵母，其蛋白质、碳水化合物、脂类、功能性色素等成分的含量见表315。由表可知，其特点在于：功能性色素、脂类、蛋白质等能够发挥特殊的功能性。
表1锁掷酵母中主要成分分析
成分 | 蛋白质（%） | 碳水化合物（%） | 脂类（%） | 功能性色素（%） | 其他（%） |
锁掷酵母 | 14.84 | 15.17 | 50.12 | 0.05 | 19.82 |
锁掷酵母中至少含有四种类胡萝卜素：
b-胡萝卜素具有最高的维生素A活性，是动物体最主要的维生素A源，由于其分子中含有多个共轭双键的特殊结构，因而易被氧化，具有清除体内自由基防治多种疾病的功效。经薄层分析、高效液相色谱及质谱分析，确认锁掷酵母中含有四种类胡萝卜素：β-胡萝卜素、g-胡萝卜素、圆酵母红素（torulen，又称红酵母烯）、红酵母红素（torularhodin），其含量分析见表1。
表2锁掷酵母中各种类胡萝卜素含量
名 称 | 锁掷酵母中各种类胡萝卜素含量（mg/kg干物料） |
β-胡萝卜素（β-carotene） | 27.01 |
g-胡萝卜素（g-carotene） | 5.24 |
圆酵母红素（torulen） | 13.11 |
红酵母红素（torularhodin） | 4.27 |
类胡萝卜素总量 | 54.51 |
锁掷酵母中含有丰富且组成合理的氨基酸：
锁掷酵母中氨基酸含量分析结果见表2。由表可知，锁掷酵母具有很好的营养价值：（1）必需氨基酸占总氨基酸的38.44%，可以很好的为畜禽提供其必需氨基酸；（2）鲜味氨基酸占总氨基酸的42.84%，能够促进畜禽进食。
表3 锁掷酵母中氨基酸组成
氨基酸 | 氨基酸含量(g/100g干菌) | 氨基酸百分含量（%） | |
必需氨基酸 | 赖氨酸 | 0.95 | 6.41 |
蛋氨酸 | 0.23 | 1.53 | |
苏氨酸 | 0.81 | 5.43 | |
苯丙氨酸 | 0.73 | 4.90 | |
色氨酸 | 0.24 | 1.63 | |
异亮氨酸 | 0.69 | 4.63 | |
亮氨酸 | 1.19 | 8.02 | |
缬氨酸 | 0.87 | 5.88 | |
非必需氨基酸 | 精氨酸* | 0.89 | 5.98 |
组氨酸 | 0.41 | 2.79 | |
天冬氨酸* | 1.48 | 9.98 | |
谷氨酸* | 1.91 | 12.89 | |
甘氨酸* | 0.85 | 5.71 | |
丝氨酸 | 0.88 | 5.92 | |
酪氨酸 | 0.57 | 3.82 | |
半胱氨酸 | 0.14 | 0.94 | |
丙氨酸* | 1.23 | 8.29 | |
脯氨酸 | 0.78 | 5.25 | |
氨基酸总量(g/100g干菌) | 14.84 | ||
必需氨基酸总量(g/100g干菌) | 5.71 | ||
必需氨基酸占总氨基酸的百分比(%) | 38.44 | ||
鲜味氨基酸总量(g/100g干菌) | 6.36 | ||
鲜味氨基酸*占总氨基酸的百分比(%) | 42.84 |
锁掷酵母中含有大量不饱和脂肪酸：
不饱和脂肪酸能使动物血清中总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇三酰甘油水平均下降而且可以提高畜禽免疫力。油酸能够降低胆固醇在血液中的含量，减少其在血管上的沉积，有预防动脉硬化等作用，同时油酸却不降低有益胆固醇的含量。营养界把油酸称为安全脂肪酸，油酸的含量多少，是评定食用油品质的重要标志。亚油酸是动物生长的必需有机酸之一，是合成n-6系列不饱和脂肪酸的前体物质。
锁掷酵母中脂肪酸组成检测结果见表3。由表可知：锁掷酵母中不饱和脂肪酸占总脂肪酸的74%左右，可以很好的改变畜禽的饲料结构，不仅可以提高畜禽的质量，还有可能通过食物链的作用提高人体机能。
表4 锁掷酵母中脂肪酸组成
脂肪酸种类 | 脂肪酸比例（%） |
肉豆蔻酸（C14:0 Tetradecanoic acid） | 0.88 |
棕榈酸（C16:0 Hexadecanoic acid） | 18.46 |
棕榈油酸（C16:1 9-hexadecanoic acid） | 0.59 |
硬脂酸（C18:0 Octadecanoic acid） | 4.60 |
油酸（C18:1 9-octadecanoic acid） | 67.08 |
亚油酸（C18:2 9.12-octadecanoic acid） | 5.41 |
亚麻酸（C18:3 Linolenic acid） | 0.50 |
花生酸（C20:0 Eicosenoic acid） | 0.47 |
花生一烯酸（C20:1 11-eicosenoic acid） | 0.42 |
其他 | 1.60 |
总不饱和脂肪酸 | 73.99 |
2．锁掷酵母培养优化条件选择
通过之前的研究发现,不同的菌种中影响其类胡萝卜素组成的主要因素有很大差异，所以我们要根据具体的菌株分析培养条件对其类胡萝卜素合成的影响，这对于研究高产单一类胡萝卜素具有指导性意义。锁掷酵母生产类胡萝卜素的代谢途径中，β-胡萝卜素和红酵母烯有着共同的前体物质γ-胡萝卜素和番茄红素。β-胡萝卜素为番茄红素两端环化的产物，红酵母烯可以由番茄红素先脱氢或先环化生成。由于β-胡条件卜素和红酵母烯性质及其相近，为了大大减少纯化难度，可以在发酵过程中通过控制不同的发酵条件来定向积累一种类胡萝卜素。
用三种不同的培养方法分别是摇瓶培养方法、7L罐分批发酵培养方法、7L罐补料分批发酵培养方法，研究不同条件下锁掷酵母类胡萝卜素的产量的变化，从而得出相应结论。通过改变碳源、PH、温度、溶氧、和有机氮源等单一条件，通过多次单因素考察方法得出锁掷酵母发酵生长最适范围和类胡萝卜素高产量培养条件，为锁掷酵母的培养开发利用提供了基础。
3.锁掷酵母的安全毒理学评价
红酵母作为一种国内为未有过食用历史的一种新原料，按要求需要进行所有阶段的毒理学实验，包括急性经口毒性试验、遗传毒性试验、28天经口毒性试验、90天经口毒性试验、致畸试验等等。
3.1急性经口毒性试验
预实验：采用100mg/kg体重，1000mg/kg体重和5000mg/kg体重的剂量，各以2~3只动物预实验。根据24h内死亡情况估计LD50的可能范围，确定正式试验的剂量组。
实验步骤：
1、昆明种小鼠20只，雌雄各半，9-11周龄，基础饲料（17.5%酪蛋白 41.5%玉米淀粉 10%蔗糖 17%麦芽糊精 4%大豆油 5%纤维素 3.5%矿物质混合物 1%维生素混合物 0.3%DL-蛋氨酸 0.2%氯化胆碱）适应性喂养3天。
2、剂量：10.0g/kg体重。
3、期间，自由饮水，在试验开始和结束时称取并记录动物体重，并且在观察期每周称取动物体重一次。密切关注小鼠日常情况。
4、若老鼠未死亡，则用麻醉处死法处死。
3.2小鼠精子畸形试验
实验步骤：
1、成年雄性昆明小鼠30只，6-8周龄，体重25g-35g，随机分成五组。
2、剂量：设三个剂量组，1/2LD50,1/4LD50,1/8LD50。阳性对照组、阴性对照组。阳性物可采用环磷酰胺40mg/kg体重-60mg/kg体重、甲基磺酸甲酯（MMS）50mg/kg体重或丝裂霉素C（MMC）1.0mg/kg体重-1.5mg/kg体重经口或腹腔注射给予（首选经口）。阴性对照选用与受试物相同体积的溶剂。受试物用蒸馏水作溶剂，于灌胃前新鲜配制。
3、经口给予，连续5天。首次给予受试物后的第35天处死。
4、标本制备：用颈椎脱臼法处死小鼠，取出二侧附睾，放入有适量生理盐水（约1ml）的小烧杯中或放入盛有2ml生理盐水的平皿中。用眼科剪将附睾纵向剪1刀-2刀，静置3min-5min，轻轻摇动，用四层擦镜纸或合成纤维血网袋过滤，吸取此精子滤液滴于清洁载玻片上，均匀推片，待玻片晾干后用甲醇固定5min，干燥后镜检观察精子形态。也可用2%的伊红水溶液染色1-2h后再作镜检。
参考文献
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[4] 仇丹，陈志荣，李浩然.β-胡萝卜素异构体的定性分析［J］.食品科学2008,29（4）：50-53.
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[10]韩梅，翟玉贵，王小波，张伟国.锁掷酵母与海洋红酵母的营养成分分析
3. 设计方案和技术路线
1.用摇床培养方法培养菌体
2.用物理方法将菌体破壁
3.将破壁后的菌体冻干成粉，方便准确计算计量
4. 工作计划
1.文献调研，培养条件的优化选择
2.进行菌体培养,适当处理后实验
3.格局实验得出数据以及结论
5. 难点与创新点
1．以南京中医药大学图书馆网站上图书、期刊、博硕士学位论文、会议论文、专利等信息资源为对象，结合收录学科范围、文献内容标引质量、数据更新时效、文献查全率等指标对相关数据库进行分析评价对不同数据库中获得的文献进行合并。
2．新食品原料的研究开发。
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