金华佛手精油的提取与活性研究开题报告

佛手(CitrusmedicaL，Var.Sarcodactylis)为芸香料柑桔属植物，是香橼的变种之一，又名佛手香橼蜜罗柑福寿橘。其果实在成熟时各心皮分离形成果瓣，细长弯曲，状如手指，因此得名佛手。该属全世界约有20多种，原产于亚洲东南部及南部。现今，在热带、亚热带地区栽培广泛，我国引进栽培约15种。在我国，根据产地不同，佛手主要可分为四种:一是产于广东、广西，称为广佛手；二是产于四川，称为川佛手；三是产于浙江，称为金佛手；四是产于福建，称为闽佛手。

佛手性温，味辛，苦、酸。入肝、脾、肺、经。《本草纲目》载:煮酒饮，治痰气咳嗽；煎汤，治心下气痛。《本草再新》曰:治气舒肝，和胃化痰，破积，治噎膈反胃，消症瘕瘰疬。《滇南本草》:补肝缓胃，止呕吐，消胃寒痰，治胃气疼痛。

从对文献分析结果来看，佛手的研究取得了很大的进展，主要表现在佛手挥发油、总黄酮、多糖的提取分离研究，化学成分的测定研究以及药理作用研究等。佛手中含有多种的化学活性物质，具有抗肿瘤、增强免疫作用、抗氧化等作用。随着对佛手研究的不断深入，利用佛手开发保健品或药品市场前景将十分广阔。

1.研究方案

（1）不同提取方法对精油提取率得率的影响

A.有机溶剂回流法：称取鲜佛手50g，打浆，加入100mL石油醚浸泡，于40℃水浴回流2h，收集残渣再用石油醚回流2h，合并两次提取液，6000r/min离心10min，取上清液减压浓缩并回收石油醚，得到佛手精油粗提物。

B.水蒸汽蒸馏法：称取鲜佛手50g，加入150mL蒸馏水，打浆，置于500mL圆底烧瓶中，通水蒸汽蒸馏2h，馏出液分去水层，用无水硫酸钠干燥，得无色透明油层。

C.压榨法：称取鲜佛手50g，打浆，随后加入0.2%的硫酸钠进行压榨，得油水混合物，离心10分钟后得透明油层。

（2）采用GC-MS分析不同提取方法对佛手精油成分的影响

采用上述的3方法提取精油，基于GC-MS分析不同提取方法对精油成分的影响。

色谱条件：色谱柱为AgilentHP-5MS(30m0.25mm0.25μm)；载气为氦气；柱流量为1.0mL/min。进样口温度为250℃；程序升温：初始温度为60℃，保持3min；先以3℃/min的升温速率升至180℃；再以6℃/min的升温速率升至200℃；最后以10℃/min的升温速率升至270℃，保持3min。

质谱条件：离子源温度为230℃；四极杆温度为150℃；电子轰击能量为70eV；数据采集扫描模式为全扫描。

（3）精油抑菌活性研究

分别研究精油抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活性。将精油加入到LB液体培养基中，使精油的终浓度分别为0.5、1、2、4mg/mL，接入50微升对数期细菌，摇匀，37℃恒温培养24h；并做不加精油的空白对照。在540nm测定吸光度，计算抑菌率。使得培养物澄清的最小精油浓度为精油的最小抑菌浓度（MIC）。

（4）精油的抗氧化活性研究

a.还原力测定：在2.5mLpH值6.6的磷酸盐缓冲液中依次加入不同质量浓度（0.5、1、2、4、8mg/mL）的佛手精油溶液2.5mL，质量分数１％的铁氰化钾溶液2.5mL，混合均匀后在50℃恒温20min，冷却，再加入2.5mL质量分数10％的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min离心分离10min，取上层清液５mL，加蒸馏水5mL和质量分数0.1％FeCl3溶液1.0mL，在波长700nm处测定吸光度，同时进行空白实验.

b.对SAFR清除作用的测定：取0.05mol/L,pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中,置25℃水浴中预热20min。分别加入不同浓度的待测品0.1ml后均加入2.5mmol/L邻苯三酚(由10mmol/LHCl配制)0.4ml,混匀后25℃水浴中准确反应4min,立即加入8mol/LHCl2滴终止反应,蒸馏水调零,在299nm处测定吸光度。空白组以0.1ml蒸馏水代替样品试液。按以下公式计算SAFR清除率〔清除率=(A空白-A样品)/A空白100%〕

(5)佛手精油纳米乳的制备及其对抗菌、抗氧化活性的影响

a.纳米乳的制备：首先根据乳化剂分层体积数选择合适的乳化剂。将水与佛手精油按质量比9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9精密称取10ml置于平底烧杯中混合均匀，在室温条件下，置于磁力搅拌器上，边搅拌边滴加表面活性剂(混合乳化剂)，同时观察瓶中物质状态的变化。在滴加过程中，乳液会出现粘度较大的状态，用偏光显微镜观察有无双折射现象，发亮的为液晶，不发亮的为凝胶;直至形成稳定透明的纳米乳。

b.取制备的佛手精油纳米乳进行抗菌和抗氧化实验，研究纳米乳对精油抗菌和抗氧化活性的影响。

2.技术路线

1、以江南大学和南京中医药大学图书馆网站上图书、期刊、博硕士学位论文、会议论文、专利等信息资源为对象，结合收录学科范围、文献内容标引质量、数据更新时效、文献查全率、查准率等指标对相关数据库进行分析评价，最终选择3个数据库进行数据收集，对不同数据库中获得的文献进行合并、查重，按照拟定标准进行文献筛选：

2、本研究筛选和优化佛手精油的提取方法，并对其主要成分进行研究，并测定其抗氧化和抑菌作用，以及进行纳米乳的制备。