1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
油菜是重要的油料作物，品种类型多，适应范围广，在世界五大洲均有分布，但以亚洲、欧洲和北美洲种植面积最大，三个洲油菜种植面积占世界总面积的95.21%[1]。油菜在我国也是最为重要的油料作物和优质的蛋白饲料作物，其种植面积和总产量均占世界的1/3，其中长江流域又占世界的1/4，是世界上最大的油菜产区[2]。 从1950年至今的60多年间，在科技创新的有力支撑下，物种和品种变革推动了我国油菜生产由低产向高产优质的革命性飞跃[3]。2001年-2006年，世界油菜生产与消费均出现较大增长，种植面积从2331万公顷增长到2735万公顷，增长17%；总产从3603万吨增长到4855万吨，增长34.7%；菜籽压榨量从3349万吨增长到4426万吨，增长32%；菜籽粕消费量由1320万吨增长到1705万吨，增长29%；菜籽粕消费量由1998万吨增长到2612万吨，增长30%。目前, 国外油菜品种的油脂含量大约为 42%-45%, 少数甘蓝型油菜品种油脂含量已达47%, 而我国油菜品种的平均油脂含量为40%左右。近5年来, 我国油菜高油脂含量品种虽呈上升趋势, 但低油脂含量品种仍然占有较大份额。这势必导致油菜业经济效益低下, 影响农民种植油菜的积极性, 限制油菜种植面积的进一步扩大。我国是油脂生产和消费大国，为了维护我国油料安全问题，提高我国国产油脂自给率，加快油菜高油、高产优质新品种的培育和推广已成为十分紧迫的任务。 转录因子是一类重要的调控子，在特定的调控途径中，转录因子对基因表达调控具有级联放大性，产生全局整体性调控效果。目前，已发现参与植物油脂代谢调控的转录因子有WRINKLED1 (WRI1)、FUSCA3 (FUS3)、LEAFY COTYLEDON2 (LEC2)和LEAFY COTYLEDON1 (LEC1)等[4][5]。其中，WRI1编码一个AP2/EREB转录因子蛋白，它可能是植物体内由蔗糖向TAG转化的一个关键的调节因子[6]。LEC1属于能结合启动子中顺式作用元件CCAAT盒的一类转录因子，能调控胚胎的发生与种子成熟，同时对胚胎形成过程中胚胎储存物的积累进行调控[7]。Kagaya等[8]研究发现，过量表达LECl能在异位胚胎发生开始前诱导种子贮藏蛋白SSP(seed storage protein)基因的表达，从而排除了胚胎发生诱导的可能。过量表达LEC1能大幅度增加转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)幼苗中的脂肪酸含量[9]，而这些基因参与缩合、碳链延伸、去饱和化等脂肪酸合成中关键反应。在LECl过表达的转基因植株中，超过58％已知的参与质体脂肪酸合成途径的酶基因表现出正调控。包括编码乙酰辅酶A羧化酶(控制脂肪酸合成的关键酶)3种亚基的基因。参与糖酵解和脂质积累的基因也出现上调。同时，转基因植株中，主要脂肪酸的种类和脂质的水平大幅度增加。在油菜(Brassica napus L.)籽中适度表达来自甘蓝型油菜的同源基因BnLEC1能提高油菜籽油脂含量[10]。 研究表明，BnLEC1是控制种子油脂合成的关键转录因子，过量表达BnLEC1 |
导致植物死亡。本课题主要对四倍体甘蓝型油菜BnLEC1基因进行了克隆，并对BnLEC1基因进行了功能验证和表达模式进行分析，希望通过分析能对BnLEC1进化模式和调控油菜种子油脂积累的作用机理有进一步的了解。 参考文献： [1]官春云．双低油菜核心竞争力的研究[J]．作物研究，2004．2：8893． [2]涂金星，张冬晓，张毅，等．我国油菜育种目标及品种审定问题的商榷[J]．中国油料作物学报，2007，29(3)：350352． [3]王汉中. 我国油菜生产三次大飞跃 [OL][J]. 2004. [4] Focks N, Benning C. wrinkled1: a novel, low-seed-oil mutant of Arabidopsis with a deficiency in the seed-specific regulation of carbohydrate metabolism[J]. Plant Physiology, 1998, 118(1): 91-101. [5]Wang H, Guo J, Lambert K N, et al. Developmental control of Arabidopsis seed oil biosynthesis[J]. Planta, 2007, 226(3): 773-783. [6]Cernac A, Benning C. WRINKLED1 encodes an AP2/EREB domain protein involved in the control of storage compound biosynthesis in Arabidopsis[J]. The Plant Journal, 2004, 40(4): 575-585. [7] Lotan T, Ohto M, Yee K M, et al. Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryo development in vegetative cells[J]. Cell, 1998, 93(7): 1195-1205. [8] Kagaya Y, Toyoshima R, Okuda R, et al. LEAFY COTYLEDON1 controls seed storage protein genes through its regulation of FUSCA3 and ABSCISIC ACID INSENSITIVE3[J]. Plant and cell physiology, 2005, 46(3): 399-406. [9]Mu J, Tan H, Zheng Q, et al. LEAFY COTYLEDON1 is a key regulator of fatty acid biosynthesis in Arabidopsis[J]. Plant physiology, 2008, 148(2): 1042-1054. [10] Tan H, Yang X, Zhang F, et al. Enhanced seed oil production in canola by conditional expression of Brassica napus LEAFY COTYLEDON1 and LEC1-LIKE in developing seeds[J]. Plant physiology, 2011, 156(3): 1577-1588. |
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
探究BnLEC1同源基因差异表达对油菜菜籽油脂积累的影响，为分子辅助育种提供有价值的分子标记。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法：
本实验拟采用用BnLEC1基因特异引物克隆目的基因，利用生物信息学软件分析BnLEC1基因的进化机理，通过QRT-PCR方法检测油菜籽在受精后不同时
技术路线： /见附件
可行性分析：
1、技术方法可行，在前期的研究中，我们对已克隆到的BnLEC1基因在油菜籽的表达情况用QRT-PCR方法进行了大量检测。该方案所采用的技术方法我们都已掌握，完全可以进行此项工作。
2、设计思路合理，实验之前，已通过大量的文献资料证实，十字花科植物的其他基因已通过该种方法进行了进化分析和表达量分析，且实验结果有绝对的利用价值。
3、实验条件具备。本毕业实习实验室属于作物遗传与种质创新国家重点实验室，具备相应的PCR仪、RNA反转录试剂盒等试验仪器和试剂。
4. 研究创新点
本研究对BnLEC1同源基因在油菜基因组中的表达进行详细研究，能揭示其表达模式差异与油脂积累的关系。
5. 研究计划与进展
2014年7月-2015年4月：
1、BnLEC1基因的克隆及鉴定工作；
2、BnLEC1基因的进化分析；
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