1. 研究目的与意义
【研究内容】
抗褐变剂对明党参悬浮细胞生长和次生代谢产物含量的影响
1、利用明党参的外植体进行愈伤组织的诱导，选择适宜的愈伤组织进行悬浮培养。
2. 文献综述
我国药用植物组织培养生产次生代谢产物的研究进展
张倩
摘要：借助于先进的生物技术手段，利用药用植物组织培养来生产及提高二次代谢产物的方法已经越来越成熟，本文介绍了近年来国内利用组织培养技术生产次生代谢产物的最新研究进展，按照次生代谢产物的种类进行了归纳整理。
关键词：药用植物；组织培养；次生代谢产物
植物的次生代谢产物是植物在长期进化中对生态环境适应的结果，对于植物本身来说次生代谢产物可提高自身保护和生存竞争能力、协调与环境关系等等功能[1]，对于人类来说保证药材质量及有效性的基础物质就是植物的次生代谢产物。在药用植物中，次生代谢产物通常是新药、新先导化合物、新化学实体的重要来源，是中药的主要活性成分，药材品质的物质基础，是中药现代化研究的重要内容[2]。
传统中药材获取的方式有两种，一是获取野生资源，然而人类盲目采挖，使野生资源日益减少甚至有些到了濒危灭绝的程度，根据资料显示列入国家重点保护、红皮书、限制进出口等濒危中药材共280种[3]。二是通过人工栽培，这不仅受到了气候、地域、季节等自然条件的限制，同时还需占用大量耕地，与农业用地产生矛盾，最重要的是在自然条件下生长的药用植物的二次代谢物的产量不易控制，而组织培养能很好的解决这些问题。在利用植物细胞生产天然产物的观点被提出后60多年以来，随着生命科学和组培技术迅速发展，提高组培细胞生长速度和提高次生代谢产物产量的研究得到较大的进展。
1、植物组织培养的优点
药用植物组织培养生产次生代谢产物与人工种植相比，具有较多优点，主要概括为：一、细胞生长快速，缩短了生长代谢周期，短期内积累大量次生代谢物；二、通过控制生长条件、激素比例及添加其他对积累二次代谢产物有用的物质来提高产量；三、利用药用植物的细胞悬浮培养体系对先导活性化合物进行生物转化，获得新的活性化合物或提高活性化合物的产率[4]；四、可以在植物组织培养中利用基因工程、代谢工程手段研究探索新的生物合成途径,有目的生成新的或价值高的次生代谢产物[5]；五、许多植物中活性产物的结构复杂特殊，很难用化学合成法，组织培养即可解决化学合成中步骤复杂、收益低且易产生环境污染等等问题。
2、植物组织培养的应用技术
近些年利用组培生产的二次代谢产物多集中在生物碱、萜类、苯丙素类、黄酮及多糖等这几种化合物上，组培技术也由从简单的固体组织培养到液体悬浮细胞培养再到发酵罐大量培养，在此基础上还研究出了二步培养、两相培养、细胞固定化培养方法；培养对象不仅有细胞、不定根，还有不需要植物激素但次生代谢物产量很高的毛状根、冠瘿；提高次生代谢产物的方式除了选择高产细胞系、调节培养条件（包括光照、温度、PH、培养基等因素）还有添加诱导子、前体物质饲养等等[6]。
除上述这些植物组织培养的常规方法外，近年来还出现一些提高组织培养物中次生代谢产物的潜在方法，例如植物细胞悬浮培养过程中对细胞外液的收集。悬浮培养过后，通常我们所利用的都是植物细胞或组织，对于培养液都是直接弃去，而现代研究表明培养液中存在植物生长过程中释放的次生代谢产物，启示我们不仅要收集植物培养液，同时要想办法的提高培养细胞渗出液。通过收集植物细胞培养液来提取细胞渗出物，是一种生产植物次生代谢的新方法[7]。且渗出物较易提取生产，因此提取细胞外液对于提高植物化合物产量有着广阔的发展前景。
3、近年来植物组织培养生产二次代谢产物的成果
植物次生代谢产物种类繁多，性质各异，仅已知结构的就有2万种以上主要包括各种氨基糖衍生物、酚类、醌类、黄酮类、香豆素、木质素、环氧化物、生物碱、喹啉糖苷、吲哚大环内脂、萘核苷、吩嗪、吡咯、萜类、甾类、皂甙、多肽类、多烯类、多炔类、有机酸毒素和色素等[8]。植物组织培养的成功与否，其中一个决定性因素就是激素配比，即使在对每种激素都已经了解其用途的情况下，具体某种植物的激素配比还是要在实验中慢慢摸索，以下归类了近几年药用植物组培生产的生物碱、黄酮、苯丙素类、萜类等次生代谢物的产量及培养时的激素配比。
表1植物组织培养生产生物碱类成分
Table1theproductionofalkaloidsinplanttissueculture
植物名 | 二次代谢产物 | 激素配比 | 含量 | 作者 |
南方红豆杉 | 二萜类生物碱 | B5 3.0mgL-12,4-D 1.0mgL-16-BA 1.0mgL-1NAA 0.5mgL-1KT | 10-DAB、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、紫杉醇、东北红豆杉素0.2046mgg-1、0.8055mgg-1、0.3947mgg-1、0.2703mgg-1 | 姚晓2014[9] |
平贝母 | 生物碱 | 1.0mgL-1NAA 0.5mgL-1KT | 组培再生鳞茎、愈伤组织和不定根中生物碱含量均高于栽培鳞茎，分别为0.0665％、0.1624％和0.0475％ | 梁庆丰2002[10] |
长春花 | 阿玛碱和长春质碱等吲哚生物碱 | MS 1.0mgL-1KT 2.0mgL-1NAA | 子房愈伤阿玛碱高，叶愈伤中长春花碱高 | 张秀省2005[11] |
石蒜 | 石蒜碱、力可拉敏、加兰他敏 | 2mgL-16-BA和0.2mgL-1NAA | 不定芽中生物碱高 | 高翠云2013[12] |
黄檗 | 小檗碱、药根碱、掌叶防己碱 | MS 0.52mgL-1BA 1.0mgL-1NAA | 叶片诱导特定条件下含量高 | 曲伟娣2007[13] |
半夏 | 生物碱 | MS 1.0mgL-16-BA和0.4mgL-12,4-D | 总生物碱含量分别为394.7μgg-1和448.8μgg-1, | 孙建玲2010[14] |
曼陀罗 | 莨菪碱、东莨菪碱 | MS 0.5mgL-12,4-D | 愈伤组织提取物中含有 | 安晓云2011[15] |
篦子三尖杉 | 高三尖杉酯碱 | MS 2.0mgL-1NAA 0.5mgL-16-BA 1.0mgL-12,4-D 0.5mgL-1KT | 悬浮培养中含量较高 | 邹露2009[16] |
铁皮石斛 | 总生物碱含量 | MS 1.0mgL-16-BA 1.0mgL-1NAA 2.0mgL-12,4-D | 香蕉汁培养基中的拟原球茎生物碱含量最高 | 李莹2012[17] |
颠茄 | 托品烷类生物碱 | MS 2.0mgL-12,4-D 0.25mgL1KT | 东莨菪碱含量为苗根的3.7倍，莨菪碱含量为对照的2.6倍 | 李姣姣2014[18] |
黄连 | 总生物碱 | 6,7-V2 1.5mgL-1NAA 0.2 mgL-1KT | 二步培养法获得总生物碱为13.8% | 张建佳2011[19] |
喜树 | 喜树碱 | MS 2.0mgL-16-BA 0.5mgL-1NAA | 油菜素内酯处理后喜树碱产量高了四倍 | 刘菲2010[20] |
雷公藤 | 总生物碱 | 1.0mgL-12,4-D 0.5mgL-1KT | 生物碱含量达6.09mgg-1DW | 李琰2008[21] |
表2植物组织培养生产黄酮类成分
Table2theproductionofflavonoidsinplanttissueculture
植物名 | 二次代谢产物 | 激素配比 | 含量 | 作者 |
荞麦 | 总黄酮 | 1.5mgL-12,4-D 0.6mgL-16-BA | 苦荞愈伤黄酮含量高，而甜荞愈伤黄酮细胞产量高 | 王鹏姬2013[22] |
三角枫 | 总黄酮 | 0mgL-12,4-D 1.5mgL-16BA 1.0mgL-1NAA 1.0gL-1IBA | 适宜培养条件下黄酮积累量大 | 刘玉民2010[23] |
三叶青 | 总黄酮 | B5 4.0mgL-16-BA 2.0mgL-1NAA 40mgL-1 | 培养物中的总黄酮含量明显高于原植株叶片,接近于根茎 | 彭昕2012[24] |
甘草 | 甘草苷、甘草素及总黄酮 | 0mgL-12，4-D 0.5mgL-1NAA 0.5mgL-16-BA | 进过指纹图谱比较，甘草细胞培养生产黄酮类化合物原植株中基本是相似的 | 李雅丽2012[25] |
银杏 | 黄酮类化合物 | MS 1.0mgL-1NAA 0.5mgL-1BA; | 叶片、子叶、根诱导的愈伤组织中黄酮含量高 | 陈颖2005[26] |
国槐 | 异黄酮 | B5 蔗糖20mgL-1 1.0mgL-12,4-D 0.2mgL-16-BA | 愈伤组织中异黄酮的最大提取量为12.045mgg-1 | 溥丽华2012[27] |
胭脂花 | 总黄酮 | MS 2.0mgL-1NAA 0.5mgL-1KT | 总黄酮含量最高,为8.395mgg-1略低于野生植株11.997mgg-1 | 宋韵霏2013[28] |
石榴 | 黄酮类化合物 | MS 1.0mgL-12,4-D 0.1mgL-1KT | 愈伤组织和悬浮细胞,分别为73.13mgg-1和69.05mgg-1,高于石榴叶含量 | 程江华2009[29] |
水母雪莲 | 黄酮类化合物 | 0.5mgL-1GA3 0.5mgL-1IBA | 黄酮类化合物含量占毛状根干重的15%,约为野生植株含量的25倍 | 杨睿2005[30] |
黄芩 | 黄芩苷 | 0.3mgL-1IAA 2mgL-16-BA | 黄芩苷为167.4mgg-1,明显高于野生黄芩的最高量 | 王梦亮2006[31] |
蒙古黄芪 | 黄酮类化合物 | MS 1.0mgL-16-BA 2.0mgL-12,4-D | 黄芪黄酮产量达到9.78mgL-1 | 刑菊展2009[32] |
非洲山毛豆 | 鱼藤酮 | 1.0mgL-12,4-D和0.7mgL-16-BA组合的MS | 培养90d后鱼藤酮的含量0.06% | 吴玉东2012[33] |
辣木 | 总黄酮 | MS 2.0mgL-16-BA MS 0.5-0.8mgL-16-BA 0.2-0.3mgL-1NAA | 总黄酮含量最高46.16mgg-1 | 张婧2013[34] |
刺五加 | 总黄酮 | MS 蔗糖40mgL-1 1.0mgL-1NAA 1.0mgL-16-BA | 总黄酮在培养40天后达474.26mgL-1 | 初旸2008[35] |
表3植物组织培养生产苯丙素类成分
Table3theproductionofphenylpropanoidsinplanttissueculture
植物名 | 二次代谢产物 | 激素配比 | 含量 | 作者 |
白蜡属杂交种 | 香豆素类 | WPM 1.0mgL-1NAA O.1mgL-1TDZ | 在水杨酸诱导下香豆素产量为0.1124mgg-1 | 周丽丽2013[36] |
杜仲 | 绿原酸 | B5 0.5mgL-1NAA 0.6mgL-16-BA | 绿原酸产量达到26.4mgL-1 | 颜日明2010[37] |
彩叶草 | 迷迭香酸 | 2.0mgL-16-BA 0.5mgL-1NAA 0.8mgL-12,4-D | 愈伤和悬浮细胞中迷迭香酸的含量分别占干重的29.83%和6.243% | 鞠倩2007[38] |
川芎 | 阿魏酸 | MS 2．0mgL-12，4-D 0．4mgL-16-BA | 继代十次后阿魏酸的含量是80.9μgg-1 | 张蓓蕾2007[39] |
罗布麻 | 绿原酸 | MB 0.3mgL-1NAA 0.3mgL-1KT 50mgL-1蔗糖(pH5.9) | 绿原酸产量达0.183mgg-1(DW) | 高小艳2011[40] |
紫苏 | 迷迭香酸 | MS液体培养上添加3.0mgL-16-芐氨基嘌呤(6-BA) 0.3mgL-1萘乙酸(NAA) | 获得高达2.283mgg-1的迷迭香酸 | 李会珍2012[41] |
白芷 | 香豆素类 | 文章中未给出 | 白芷愈伤组织中总香豆素的质量分数是白芷药材中的9.7倍 | 梁玉玲2014[42] |
花曲柳 | 秦皮甲素 | 1/2WPM 1.2mgL-1NAA 0.07mgL-1TDZ, | 秦皮甲素最大积累量出现在悬浮培养的第9天，最高可达0.800mgg-1 | 刘孚婧2014[43] |
瑞香狼毒 | 香豆素类 | MS 0.3mgL-1BA 0.1mgL-1NAA | 不定芽总黄酮的累积量在第5周达到最高，为0.218g | 黄嘉琦2013[44] |
青蒿 | 新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸 | MS 0.5mgL-12,4-D 1mgL-16-BA | 21d可获得青蒿次生代谢产物含量最高40.47μgg-1、222.34μgg-1、30.89μgg-1 | 郭新荣2014[45] |
明党参 | 7-羟基香豆素、花椒毒酚等香豆素 | MS 0.5mgL-12,4-D 0.2mgL-1KT 1.5mgL-1NAA 0.5mgL-1NAA | 7-羟基香豆素、花椒毒酚含量较高分别为3.7939mgg-1、0.8384mgg-1 | 步达2014[46] |
表4植物组织培养生产类成分
Table4theproductionofterpenoids,anthraquinoneandpolysaccharideinplanttissueculture
植物名 | 二次代谢产物 | 激素配比 | 含量 | 作者 |
霍山石斛 | 多糖 | 改良的MS培养基,其中微量元素、有机元素减半，大量元素:KNO330mmolL-1、 MgSO47H2O1.5mmolL-1和CaCl22H2O4.5mmolL-1 | 多糖产量和多糖含量分别为5.22gL-1和11.9％ | 魏明2006[47] |
茜草 | 蒽醌 | MS 2mgL-12，4-D 0.1mgL-1KT | 愈伤组织中蒽醌含量为干重的0.4%~1.2%，经rolB和rolC基因转化后含量为干重的1.9%~3.2%和1.4%~2.3% | 曹高山2008[48] |
皱叶酸模 | 大黄素 | MS 2.0mgL-16-BA 0.4mgL-12,4-D | 愈伤组织和野生皱叶酸模根部中的大黄素含量分别为6.24%和7.70% | 李慧2012[49] |
唐古特大黄 | 总蒽醌 | MS 1.0mgL-12,4-D 1.5mgL-16-BA 2.5mgL-1NAA | 培养第30d时为最高产量,达0.54mgg-1DCW | 舒孝和2009[50] |
人参 | 人参皂苷 | 3/4MS 5.0mgL-1IBA 0.1mgL-1KT 4%蔗糖 | 人参不定根总皂苷和多糖质量分数为2.25mg/g和2.73% | 王娟2012[51] |
西洋参 | 三萜皂苷 | MS 2mgL-12,4-D，0.25mgL-1-KT | 西洋参两步培养法获得了较高的皂苷产率31.52mgL-1 | 刘辉2012[52] |
甘草 | 甘草酸 | 4.0mgL-12,4-D 0.5mgL-1KT | 悬浮培养甘草酸的质量分数可达到81．6mgg-1，比生药中还要高出51．08％ | 杨会琴2006[53] |
大叶白麻 | 三萜类 | MS 0.2mgL-16-BA 0.6mgL-1NAA | 附加5%蔗糖最佳三萜类含量达0.72% | 邢思磊2011[54] |
青钱柳 | 熊果酸、齐墩果酸等三萜酸 | MS十0.5mgL-12,4-D NAA0.3mgL-1 KT1.0mgL-1 3%蔗糖 | 悬浮培养细胞总三萜酸、熊果酸和齐墩果酸产量分别可达1179.85mgL-1、443.64mgL-1和159.00mgL-1 | 尹忠平2011[55] |
白桦 | 三萜物质 | B5 0.4mgL-16-BA 0.2mgL-1TDZ | 悬浮细胞中三萜物质积累最高,最高含量达到14.3638mgg-1（DW）。 | 王博2008[56] |
4结语
药用植物组织培养总体可以分为三步：首先是愈伤组织、悬浮细胞、不定根、不定芽等植物细胞、组织或器官培养成功；其次是提高植物细胞内次生代谢产物含量或诱导产生原植物中不含有的次生代谢产物；最后阶段就是利用反应器系统进行植物培养的放大化，以实现大批量生产二次代谢产物的目标，最终将小规模的实验室培养转化到工业化生产。
当药用植物中次生代谢产物含量达到一定程度之后，可利用反应器规模化生产药用植物次生代谢产物，是一种生产药材原料的新方法，可以短期内获得大量的次生代谢产物，起到保护天然中药资源的作用，也进一步的推动我国药用植物的产业化发展，对我国药用植物资源的可持续利用有着重要的意义。
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3. 设计方案和技术路线
4. 工作计划
2022.12022.2查阅关于明党参文献，整理收集药植组培方面资料
2022.32022.4进行明党参愈伤组织诱导及建立明党参悬浮培养体系
2022.42022.5研究抗褐化剂对出现褐化的明党参悬浮细胞的影响
5. 难点与创新点
明党参分布于江苏、安徽、浙江等省，是华东地区著名药材之一，由于人类的过度利用及自身生物学特性，其分布区和个体数目正日益减少，1984年被列为国家三级濒危保护植物。植物组织（细胞）培养在中草药方面的应用前景是非常广阔，建立明党参悬浮细胞培养一方面可以进行快速繁殖，为明党参种质资源的保护提供有效途径；另一方面通过细胞悬浮培养条件、添加物的调控来获得大量有效代谢产物。
明党参中含多种活性成分，如多糖、磷脂、氨基酸、甘露醇、香豆素、不饱和脂肪酸等，前期本课题组从明党参中发现并分离出多种呋喃香豆素类成分。呋喃香豆素其具有抗肿瘤、光化学作用、抗HIV等多种药理活性，该类成分将受到了愈来愈多关注。
本实验旨在获得更多的明党参中的有效成分呋喃香豆素，而目前实验所需解决明党参在悬浮培养中出现的褐化现象，为后续利用悬浮细胞生产香豆素奠定基础。
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