1. 研究目的与意义
一、毕业设计的内容1、理论知识学习与实验前期准备根据课题实验内容，查阅光遗传学、免疫组织化学、遗传学、神经生物学相关的文献资料，了解免疫组化，荧光双标、三标的实验方法，学习共聚焦成像，计算机辅助胞体-树突形态学重构，全视网膜细胞位置重构，小鼠基因型鉴定PCR的实验分析技术，搜集实验材料。
2、免疫组化及形态学定量分析根据确定好的实验方法，对ChAT-ChR2-EYFP小鼠进行视网膜取材，分别制作铺片标本和切片标本，通过各种类型视网膜神经元的特异标记物抗体，进行免疫组化实验，从而实现对ChR2-EYFP基因在视网膜中表达的定位，以及表达该基因的神经元类型的鉴定，明确其在视网膜中表达的特点。
二、毕业设计的意义光敏感通道蛋白(Channelrhodopsin-2，简称ChR2)作为一种非选择性阳离子通道，可以被光特异性的激活，进而使离子通道打开，这样就实现了光对神经元的控制。
2. 文献综述
视网膜中自主感光神经节细胞和光遗传学的研究进展 刘爱林摘要：视网膜中表达感光蛋白-视黑质(melanopsin)并因此具备自主感光的能力的神经节细胞称为自主感光神经节细胞（intrinsically photosensitive retinal ganglion cells，ipRGCs）。
ipRGCs 根据其形态学和生理学特征的差异分为五个亚型，每个亚型具有不同的光反应特性和功能。
光敏感通道蛋白(Channelrhodopsin-2，简称ChR2)作为一种非选择性阳离子通道，可以被光特异性的激活，进而使离子通道打开。
3. 设计方案和技术路线
一、研究方案：1.制作ChAT-ChR2-EYFP转基因小鼠的铺片和切片标本，通过免疫组化，确定EYFP阳性细胞形态特征，及树突在INL的三维位置；2.制作ChAT-ChR2-EYFP转基因小鼠的铺片标本，通过免疫组化，确定全视网膜EYFP信号的二维分布；3.制作EYFP阳性细胞切片标本，将EYFP阳性细胞与ChAT、PA1-780、HPC双标，确定ChR2-EYFP转入基因的表达属性。
4.制作EYFP阳性细胞切片标本，将EYFP阳性细胞与GlyT1、GABA三标，确定ChR2-EYFP转入基因的表达属性。
二、技术路线：测定转基因小鼠基因型→取材→制作铺片和切片标本→免疫组化（EYFP荧光抗体信号放大，荧光双标，荧光三标）→共聚焦成像形态学重构及定量分析
4. 工作计划
2022年1月5日 ～3月6日 材料采集、文献搜集、相关实验技术的摸索2022年3月7日～ 4月15日免疫组化，得到结果 2022年4月16日～5月15日数据分析和形态重构 2022年5月15日～5月30日实验总结，撰写毕业设计书面报告
5. 难点与创新点
ChR2是一种非选择性阳离子通道蛋白，能被特定的光激活，因此，这类通道可作为通过光控制神经元活动的研究工具。
ChAT-ChR2-EYFP转基因小鼠在脑内胆碱能神经元中能够表达ChR2，但目前对于它在视网膜中的表达模式还不清楚。
本实验拟通过多学科方法，首次对该品系转基因小鼠视网膜中ChR2-EYFP的表达模式进行鉴定，这将为后续工作中使用以该小鼠为工具，研究特定视网膜神经元的功能，及其所在微环路的结构奠定基础。
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