1. 研究目的与意义
泽泻始载于《神农本草经》，列为上品，具有利水渗湿，泄热通淋和降血脂的功能，主治小便不利、热淋涩痛、水肿胀满、泄泻、淋症、遗精等症。泽泻为泽泻科植物泽泻Alisma orientale（Sam．）Juzep．的干燥块茎。三萜类化合物是道地药材建泽泻中的主要药效成分，植物萜类合成途径中关键酶的克隆、表达和调控是近年来研究的热点，鲨烯合酶(Squalene Synthase, SS) 能够催化两分子C15的法呢基焦磷酸(Farnesyl diphosphate, FPP) 生成一分子C30的鲨烯，是碳源流向三萜类化合物的关键调节酶，为深入研究AoSS基因的功能及表达，将前期克隆获得的泽泻鲨烯合酶基因cDNA(JX866770) 构建到原核表达载体pCzn1上，并在大肠杆菌 BL21中进行诱导表达获得目的蛋白；以此目的蛋白进行体外酶促反应验证其功能，进一步研究其表达规律，在此基础上，利用该蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体，ELISA 检测抗体效价，Western blotting 检测特异性；用制备得到的抗体免疫检测泽泻 AoSS 在不同组织中的表达情况，原核表达载体的成功构建、基因功能的进一步验证及快速免疫检测方法的建立为进一步开展AoSS 基因功能及其调控的研究奠定基础，为泽泻资源性成分原萜烷型三萜的合成生物学应用提供科学依据。
2. 文献综述
文献综述
摘要： 本文综述了泽泻的化学成分、药理作用、分子生物学研究、质量影响因素等方面，以及SS在植物体内的作用机制及其基因的调控并可为利用植物基因工程改善中药材品质奠定基础，为合理开发利用泽泻资源提供理论依据。
关键词： 泽泻；三萜类；分子生物学；鲨烯合酶
3. 设计方案和技术路线
1.研究内容
①关键酶基因表达载体构建。将经RACE法克隆的AoSS关键酶基因的cDNA，插入表达载体pCzn1酶切位点间，获得重组质粒pCzn1-SS。
②IPTG诱发原核表达。将构建质粒转化表达宿主菌E.coli BL21，IPTG诱导表达，超声破碎菌体，SDS-PAGE蛋白电泳分析。
4. 工作计划
2022.2.202022.3.5 查阅泽泻关键酶AoSS相关文献
2022.3.62022.3.31 学习仪器的结构与相关操作
2022.4.12022.4.15 准备实验材料、试剂、设备
5. 难点与创新点
原萜烷型四环三萜类化合物是泽泻属等少数植物类群中所特有的活性成分，生物工程是提高原萜烷型四环三萜类化合物合成效率的重要途径。其中关键酶的作用决定了下游萜类化合物的组成和含量，通过调控这些关键酶的表达活性，可以提高植物中相关萜类化合物的产量。在分子水平上，三萜生物合成过程中的许多步骤尚未得到完全揭示，这一代谢通路的复杂性，缺乏适当的代谢通路中间产物进行生物化学研究。植物萜类合成途径中关键酶的克隆、表达和调控是近年来研究的热点，植物AoSS基因的过度表达可以提高次生代谢产物的产率。本研究为AoSS在植物体内的作用机制及其基因的调控与表达提供了理论依据，并可为利用植物基因工程改善中药材品质奠定基础。
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