水稻籼稻品种Sinna Sivappu抗褐飞虱遗传分析及基因定位开题报告

1、研究意义

褐飞虱(NilaparvatalugensStl)，属同翅亚目、飞虱科水稻单食性害虫，具有多种生物型。褐飞虱是我国及亚洲稻区的主要害虫之一，它不仅可以吸取水稻的汁液，直接危害水稻，显著降低水稻产量和品质，同时还是水稻草状丛矮病和齿叶矮缩病等水稻主要病毒病的传播介体，有利于水稻纹枯病、小球菌核病的侵染[1-2]。当前对褐飞虱的主要防治措施是靠化学杀虫剂。但是化学杀虫剂不仅对人畜健康产生威胁，还会杀死褐飞虱的天敌，使褐飞虱产生抗药性等，致使褐飞虱的再猖獗[3]。因此，在针对褐飞虱的综合治理体系中，抗虫品种的选育和利用已证明为一种安全、经济、有效的措施[4]。

实践表明具有中等抗性的抗虫品种或由多基因控制的抗虫品种比单基因控制的抗虫品种具有更持久的抗性。因此鉴定、发现和克隆不同来源的抗褐飞虱基因，是培育出抗褐飞虱品种的重要基础。本研究以来自斯里兰卡抗褐飞虱材料SinnaSivappu为研究基础，利用苗期集团法和SSR标记，以与感虫品种所构建的F2群体进行全基因组的QTL检测，进行抗褐飞虱基因的初定位。

2、国内外研究进展

2.1、水稻对褐飞虱的抗性鉴定

水稻对褐飞虱的抗性鉴定方法是研究水稻对褐飞虱的抗性机制以及克隆抗褐飞虱基因的关键。水稻抗褐飞虱的表现型主要从水稻受害程度与褐飞虱对水稻的反应两方面来判断。在材料筛选和研究中通常采用人工鉴定方法，以达到大批量、指标量化和可重复的要求。

目前常用的抗性鉴定方法有：苗期集团鉴定法、分蘖盛期单株鉴定法、田间鉴定法和蜜露量测定法等。陈英之等[25]采用苗期群体筛选鉴定、分蘖期单株鉴定和大田自然诱虫鉴定三种方法，分别测定5个新育成的优质高产新品系对稻褐飞虱的抗性反应，结果显示，在苗期接虫鉴定情况下水稻的抗性表现不稳定，但随着苗龄的增大，其抗虫性有不同程度地提高，分蘖期和抽穗期鉴定更能准确地反映水稻品种成株期的抗性水平。

2.2、水稻抗褐飞虱基因研究概况

抗性品种选育关键在于利用好的抗性基因[5]。因此，种质资源鉴定和杂交后代的抗性选择是培育抗虫品种的基础[6]。自20世纪70年代以来，国内外相继开展了水稻褐飞虱抗性基因的发掘工作。陈建明等从浙江省769份水稻种质资源中筛选出93份抗级为0-5级的抗性资源[16]。谭玉娟等对广东省7368份水稻材料进行选择，筛选出63份抗性资源，包括白兰11、白比考等[17]。黄凤宽等采用苗期群体鉴定法从广西383份水稻材料中发掘出107份抗褐飞虱兼抗白背飞虱的稻种资源，这些抗性资源部分已经在水稻育种实践中利用[18]。

迄今已确认和报道的水稻抗褐飞虱基因有36个，其中21个为显性基因，15个为隐性基因。在这些基因中，有23个基因被精细定位，分别为Bph1、Bph26/Bph2、Bph3、Bph6、bph7、Bph9、Bph12、Bph14、Bph15、Bph17、Bph18、Bph19、Bph20、Bph21、Bph27、Bph27(t)、Bph28(t)、bph29、QBph3、QBph4、QBph4.2、Bph31、Bph32、Bph33[7]。

其中Bph3[8]、Bph6[11]、Bph9[9]、Bph14[10]、BPH18[12]、Bph26[13]、bph29[14]、Bph32[15]已经被成功克隆。并且这些基因主要集中在4，6和12号染色体上。抗褐飞虱基因的克隆，有利于加快水稻抗褐飞虱品种的培育，并且对研究水稻抗褐飞虱的分子机制具有重大的意义。

Bph1是鉴定出来的第一个水稻抗褐飞虱基因，来源于印度品种Mudgo、CO22和MUT15，并且已被精细定位于12号染色体5.8cM区间内[19]。Bph3来源于品种Rathuheenati，在4号染色体上，对生物型Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ均有抗性[8]；Bph6已被精细定位于第4染色体25kb的范围内；Bph9来源于Kaharamana，定位于12号染色体上，对生物型Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ有抗性[9]；Bph12被精细定位于第4号染色体短臂的1.9cM，且对生物型Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ均有抗性[20]；在药用野生稻中发现了Bph14，并且定位于3号染色体34kb的范围，且对生物型Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ有抗性[10]。Lv等利用含有Bph15的重组自交系和TN1构建的BC2F2群体，将基因定位在0.0269cM的遗传距离内[21]。BPH18和BPH26是功能不同的等位基因，BPH18同时参与排趋性和抗生性作[22]。Tamura等将Bph26基因定位在分子标记DS-72B4和DS-173B之间135kb之内[13]。Rahman等在小粒野生稻基因渗透系中发现了两个抗褐飞虱的位点，命名为Bph20和Bph21，分别定位在第4染色体短臂和第12染色体长臂，其区间大小分别为193.4kb和194kb[23]。Wang等将Bph29定位在第6号染色体上标记BYL8和BID2之间共24kb的区间内[14]。Prahalada等将Bph31定位在第3染色体标记PA26和RM2334之间457kb[24]。

HuJ等利用抗虫品种SriLankan和感虫品种9311，将抗虫基因Bph33定位于距离4号染色体短臂0.91-0.97Mb的60kb范围内[7]。还有其他的抗性基因也被进行定位和研究。这些抗性基因的定位与克隆，为之后进行抗性品种的选育和鉴定具有重要的作用。

到目前为止，水稻抗褐飞虱种质资源的筛选和抗褐飞虱主基因的定位已经取得了很大的进展。但由于褐飞虱存在多种生物型，而目前所发现的基因中只有很少的基因同时对多个褐飞虱生物型具有抗性。因此我们需要不断地去发掘抗谱广，抗性强的新基因，促进抗褐飞虱品种的选育。

3、应用前景

由于褐飞虱存在多种生物型，而目前所发现的基因中只有很少的基因同时对多个褐飞虱生物型具有抗性。因此我们需要不断地去发掘抗谱广，抗性强的新基因，促进抗褐飞虱品种的选育。

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研究目标：

以来自斯里兰卡的抗褐飞虱材料SinnaSivappu为研究基础，利用苗期集团法和SSR标记，以与感虫品种所构建的F2群体进行全基因组的QTL检测，对该抗褐飞虱基因进行初定位。利用SinnaSivappu与感虫品种02428回交，构建了只含有该基因的近等基因系，对其进行精细定位。

研究内容：

用含有抗褐飞虱基因的籼稻品种SinnaSivappu与褐飞虱极感品种02428配组合，构建SinnaSivappu/02428的F2群体。利用苗期集团法对F2:3家系进行表型鉴定。亲本SinnaSivappu和02428分别作为抗感对照。然后利用实验室覆盖水稻12条染色体的公共引物筛选SinnaSivappu和02428之间具有多态性的SSR标记，用已经获取表型数据的F2:3家系构建连锁图谱，获取初定位区间。利用只含有Bph32(t)位点的家系和感虫亲本02428回交构建近等基因系，用初定位的两端标记从近等基因系群体中筛选交换单株，并对交换单株进行表型验证，开发区间内标记缩小定位区间，并将其定位在较小的区间内，最终实现对Bph32(t)的精细定位。

拟解决的关键问题：

本研究初定位所检测的抗褐飞虱QTL贡献率比较小，需与以感虫亲本为回交亲本进行回交，纯化遗传背景，排除其他抗褐飞虱位点的干扰。

研究方法：

1、苗期集团法

每个家系（品种）约30粒种子装入网袋内浸种2d，催芽1d，以确保各家系（品种）生长一致。待种子露白后，分别播种于直径8.5cm、高9.0cm，盛满营养土的圆形塑料钵中（钵底部有一个小孔，便于渗透吸水）。每个家系设2次重复，完全随机排列。每60个塑料钵（包括抗虫亲本对照和感虫亲本对照各2钵）置于一个周转箱内，箱内保持2cm左右水层。待苗生长到2叶1心期，接种前3d，剔除病苗、弱苗，保证每钵剩余25~30棵长势均匀的健壮苗。平均每株接入2~3龄褐飞虱若虫5~7头，放入罩有尼龙网的养虫笼内，让褐飞虱自由取食。自然光照，室温25~28℃，湿度60%。当感虫亲本死亡率达到95%以上时统计各家系（品种）的死苗率，对每个家系（品种）进行0~9级评定。

2、提取DNA

采用CTAB法制备DNA样品。取新鲜水稻叶片200~300mg，研磨成细粉；加入600μL的CTAB提取液，置65℃水浴30min；加入700μL氯仿，12000r·min-1离心5min；转移上清液至另一离心管中，加入240μL异丙醇，13000r·min-1离心5min；弃上清液，加400μL70%乙醇，12000r·min-1离心5min；弃70%乙醇，风干；加100~20μLTE，溶解后4°C保存。

3、SSR标记

在PCR仪中进行扩增反应，95°C预变性5min；95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸1min，共进行34个循环；72°C延伸7min。扩增产物经8%的非变性PAGE胶分离后，银染显色。利用灯箱观察DNA条带，将扩增产物在双亲间表现明显多态的引物用于F2及BC2F2群体的分析。

技术路线：

实验方案：

1、构建群体：利用含有抗褐飞虱基因的籼稻品种SinnaSivappu与褐飞虱极感品种02428配组合，构建SinnaSivappu/02428的F2群体。利用苗期集团法对114个F2:3家系进行表型鉴定。亲本SinnaSivappu和02428分别作为抗感对照。

2、初定位：利用实验室覆盖水稻12条染色体的公共引物筛选SinnaSivappu和02428之间具有多态性的SSR标记，用已经获取表型数据的114个F2:3家系构建连锁图谱，获取初定位区间。

3、精细定位：利用只含有Bph32(t)位点的家系和感虫亲本02428回交构建近等基因系，用初定位的两端标记从近等基因系群体中筛选交换单株，并对交换单株进行表型验证，开发区间内标记缩小定位区间，并将其定位在较小的区间内，最终实现对Bph32(t)的精细定位。

可行性分析：

1、该实验选题恰当，实验方法明确，实验本身难度适中；

2、实验室课题组经费充足，具备足够的实验条件；

3、在实验过程中，导师和师兄师姐能够提供充分的意见和实验指导，具备较好的实验条件。

综上，该实验具有较强的可行性。

利用水稻全基因组引物对材料进行PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对其进行精确的分离。以感虫亲本为回交亲本进行回交，纯化遗传背景，排除其他抗褐飞虱位点的干扰。

2018年7月-2018年11月：在海南收获F2:3群体400个单株，随机选取进行表型鉴定，用覆盖全基因组的公共引物筛选多态，进行初定位，并且完成文献综述。

2018年12月-2019年3月：取南繁群体的叶片进行精细定位。挑选交换单株进行表型鉴定和SSR分子标记，进一步精细定位。期望最终将其定位在一个较小的区间（200kb）。并阅读相关文献。

2019年3月-2019年5月：分析结果，完成毕业论文撰写。