1. 研究目的与意义
内容：1. 通过对转染后的CHO-S工程细胞培养，筛选出稳定性高表达细胞株，并最终将稳定性表达细胞株培养到达2*10*6cells/mL,提高人凝血因子的产出率2. 对表达产物的鉴定，了解并掌握WB的操作原理，。
3. 细胞培养最适宜条件摸索，以及设计稳定性细胞株的筛选方案。
4. 运用加压筛选对重组的工程细胞进行稳定性表达细胞株的筛选，并建立细胞株。
2. 文献综述
重组人凝血因子基因在CHO-S细胞中稳定性表达及鉴定王 炼1，2（1.南京中医药大学翰林学院，江苏 泰州 225300；2.上海新生源医药集团有限公司，上海 202210）摘要：基因工程改造人凝血因子是一项重大的突破的生物药品，打破了人血浆制剂引发的血液传染疾病的弊端，避免了艾滋病等靠血液传染疾病的传染源；摸索生产工艺优化生产路线，通过重组人凝血基因改造的工程细胞培养，目的基因表达产出蛋白，扩大细胞培养，来增加制剂的产量，从而减轻病患者的经济与精神的负担。
该技术更具活力和发展前景。
0 引言人凝血因子是内源性凝血通路中一种重要的因子，即是凝血因子IX的活化，又参与凝血因子X辅助激活形成凝血酶原，形成凝血酶。
3. 设计方案和技术路线
1、 工程细胞的复苏培养1.1 细胞的复苏及贴壁培养及筛选从液氮中取出冻存工程细胞，迅速加入37℃水浴锅中，来回轻摇解冻，加入适当培养基混匀后，加入离心管中置于离心机中离心（1000rpm，5min）后，弃去上清液，加入适当培养基进行倍数稀释，并进行细胞计数，以确定接种的细胞密度；吸去培养基4mL和1mL细胞液，共计5mL，置于37℃培养箱中，黑暗培养。
向培养基中加入适当抗生素进行加压筛选，去除野生型的细胞。
在细胞培养第4天时去细胞培养液，进行产物检测。
4. 工作计划
第一阶段（2022.12~2022.01） 搜集学习资料，学习细胞培养方法及操作注意事项第二阶段（2022.02） 选题，确定课题，查找学习相关文献资料第三阶段（2022.03~2022.04） 完成开题报告，进行细胞培养，筛选条件摸索，细胞表达产物表检测第四阶段（2022.05） 撰写毕业论文
5. 难点与创新点
1.基于G418加压筛选的原理进行稳定性高表达细胞株筛选。
2.应用有血清培养基以及含血清培养基不同比例混合培养细胞并最终过渡为无血清培养基培养细胞，减少血清带来的污染风险。
3.运用WB对细胞培养上清进行表达检测，以及ELISA的抗原或抗体的固相化忌抗原或抗体的酶标记，加入底物与酶反应进行显色，间接进行定性定量的分析。
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