具有CUL4A抑制活性的化合物虚拟筛选及活性研究开题报告

研究方案：

一、计算机辅助分子设计进行虚拟筛选

1．sybyl 软件进行初步筛选

1.1 先建立存放需要对接的蛋白（CRBN）和小分子的文件夹并设置对接文件夹路径

1.2 准备蛋白，删去无关的水分子和离子

1.3 产生活性位点，对接小分子

1.4 保存构象

2. DS（CDOCKER）软件进精细筛选

2.1 准备受体蛋白（CRBN），删除水分子

2.2 定义受体蛋白的活性位点

2.3 准备配体分子

2.4 分子对接设置参数进行CDOCKER 计算

Input Receptor 参数，设置受体蛋白;

Input Ligands 参数，指定对接配体;

Pose Cluster Radiius设为0.5

Orientations to Refine s设为0.9999

2.5 分析分子对接CDOCKER结果

3.分析结果，筛选出先导化合物

二、细胞水平测试体外抗肿瘤活性

1 材料

1.1 细胞株：乳腺癌系MCF-7

1.2主要试剂及耗材：

MTT溶液 、 PBS溶液、二甲基亚砜

一次性细胞培养六孔板、二十四孔板、九十六孔板

胰蛋白酶 、 胎牛血清

1.3 相关试剂的配制：

MTT溶液: 用5ml MTT溶剂直接溶解25mg MTT粉末制成5mg/ml的工作液，用试剂盒内提供的除菌套装以除去溶液中的细菌，该溶液可4℃避光短时间保存。

胰酶配制：0.25g胰酶，加入到100mlPBS中，低速搅拌。

1.4 仪器设备

多功能酶标标仪 PCR仪

2 方法

2.1 细胞培养

细胞冻存（预先配制冻存液10%DMSO ＋90%牛血清）

（1）将贴壁细胞取出观察情况

（2）情况良好，则倒出培养基，用PBS缓冲液洗涤，加入胰酶，放入CO2孵箱中3~7分钟

（3）取出观察情况，大部分拉出即可

（4）加入培养基DMEM将壁上细胞吹下，放入到离心管中，放入离心机中（1000转，5min）,细胞与培养基分离弃去培养基。

（5）加入血清，重悬，混合

（6）放入试剂瓶中，放入4℃冰箱中30min

2.2 MTT法检测细胞增殖

（1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）

（2）5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况

（3）5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

（4）每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

（5）终止培养，小心吸去孔内培养液。

（6）每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

（7）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲 基亚砜）

2.3利用Graphpad prism 6 mac 软件处理数据

三、筛选化合物，进行分析

技术路线：