1. 研究目的与意义
一、主要内容
1.复合磷脂脂质体的制备精密称取一定量的卵磷脂、氢化大豆磷脂、胆固醇。薄膜分散法制备脂质体并用探头超声，控制脂质体粒径。得到两种粒径的脂质体，用马尔文纳米粒度仪测定其平均粒径。
2.脂质体人工皮肤膜的制备将尼龙膜通过加热的方式粘在嵌套的底部，向嵌套中加入小粒径脂质体，将嵌套放入24孔细胞板，装入离心机，离心，将嵌套水平旋转180再加入小粒径脂质体，离心，去除表面残留的液体；转移至鼓风干燥箱，加热干燥。干燥结束后，加入大粒径脂质体50μL，离心，去除表面上清液，进行3次冻-融循环，即得。离心条件：2000r/min，10min。
2. 文献综述
脂质体人工皮肤膜的研究进展
摘 要：经皮给药制剂的设计和处方优化中需要大量应用动物或人的皮肤开展透皮吸收实验，而真实皮肤的使用越来越受到限制，且重现性不佳，这为人工皮肤模型的发展提供了需求基础。脂质体人工皮肤膜由支撑膜和膜上紧密堆积的脂质体层组成，是一种模拟皮肤脂质组成和结构从而模拟皮肤屏障功能的模型。笔者综述脂质体人工皮肤膜的组成、制备、应用、表征技术等，并对未来的前景进行展望。
关键词：经皮给药；脂质体人工皮肤膜；动物皮肤；人皮肤
众所周知,经皮给药是除口服以外的主要给药途径之一,其传递系统是继口服、注射之后的第三大给药系统，它能避免肝脏及胃肠道首过效应，具有缓释长效、给药方便、可随时中止用药、能够避免口服给药的首过效应及胃肠道副作用、患者顺应性好等优势[1]等优点。皮肤是人体最大的器官，皮肤最外层的角质层，是药物经皮吸收的主要屏障,因此,不管是局部给药还是全身给药,经皮给药制剂处方的设计和优化都需要开展体外透皮吸收实验,以评价经皮渗透性能或优选制剂处方工艺。
1.人工皮肤膜
为了评价透皮吸收制剂的给药效果，在体外评价中需要广泛应用离体皮肤进行渗透能力考察。但是，由于皮肤的屏障功能受动物种属差异、身体部位差异、脱毛处理、动物个体差异等诸多因素的影响，导致透皮吸收实验结果相差很大且实验的可控性与重现性不佳。另外，剥取动物的皮肤也存在伦理学问题，而人皮肤更是难以获得，因此，为了寻找真皮的替代品，人工皮肤膜应运而生。
最初，Ponec等[2]将人角质形成细胞接种在薄膜上使其增殖分化而形成一种皮肤等价物，并作为皮肤刺激性的模型，之后利用此方法衍生了几种商业化的替代人表皮(EpiSkin，EpiDerm，SkinEthic)或全皮(Phenion)[3]的人工皮肤模型，多用于皮肤的光毒性、刺激性研究中，近年来也有人将其应用到药物的透皮研究中。但研究发现这些重组的皮肤模型与人皮肤相比，药物在其中的通透性过高[4]，并且价格昂贵且培养周期较长从而限制其在药物透皮研究中的使用。
为了简化药物皮肤渗透性的预测，几种体外模型已经被提出，如硅氧烷膜[5]、角质层替代物模型(SCS)[6]、皮肤平行人工渗透模型( Skin-PAMPA)[7]、磷脂囊泡基质渗透模型(the phospholipid vesicle-based permeation assay,PVPA)[7]等。
目前文献报道的人工皮肤膜主要是借助于简单的改性技术制备,与真实皮肤的拟合度较低,直接导致体外透皮实验结果可信度不高。脂质体是由脂质双分子层（由磷脂和胆固醇组成）构成的封闭囊泡，在近几十年的研究中被作为皮肤给药和药妆产品的活性载体，证明脂质体与皮肤脂质有很好的相容性[8,9]，可基于脂质体技术,模拟皮肤角质层的组成和结构,并通过脂质体融合改性人工膜，致力于研发一种重现性好且能模拟真实皮肤的人工皮肤膜，能够替代动物皮肤在体外透皮试验中的应用。
最新的研究表明，采用模拟皮肤脂质组成的磷脂对膜进行改性制备的人工皮肤膜，其与真实皮肤体外透皮结果的相关系数达到了0.95，可以替代皮肤用于体外透皮性能评价[10]。
2.PVPA人工皮肤膜模型
最初的PVPA模型是由Flaten等[11]提出，用做药物在肠道渗透性研究的模型。该模型由支撑膜和膜上紧密堆积的脂质体层组成，是一种模拟皮肤角质层屏障的新模型[1]。Flaten等[11-13]认为PVPA模型具有作为药物高通量筛选模型的潜力，并且可以通过对脂质体组成的调整来模拟不同的吸收屏障。由此，2种用来评估药物皮肤渗透性的Skin-PVPA模型被提出，分别是PVPAc和PVPAs。PVPAc是由用卵磷脂和胆固醇制备的脂质体制得，PVPAs用皮肤中主要的脂质成分神经酰胺，胆固醇，游离脂肪酸，胆固醇硫酸酯等制备。Engeslang等[7]检测了6个药物在这两个模型中的渗透率，并与文献中这些药物在不同动物皮肤中的渗透率比较，大部分药物的渗透顺序和动物皮肤一致。
随后，Skin-PVPA模型被应用到药物载体对透皮吸收的影响。Palac等[14]以PVPAc和PVPAs为渗透屏障考察了模型药物双氯芬酸钠的溶液剂与普通脂质体，变形脂质体，醇质体3种载体制剂的渗透行为。结果显示，与溶液剂相比，在PVPAs中，3种脂质体制剂均促进了双氯芬酸钠的渗透，而在PVPAc中4种剂型的渗透无明显差别。为了进一步证明Skin-PVPA模型在药物处方研究中的潜力，Engesland比较了Skin-PVPA模型和市售的EpiSkin模型在区别3个模型药物（阿昔洛韦、咖啡因、氯霉素)的溶液剂和脂质体制剂渗透行为的能力。渗透实验结果显示，PVPAs模型能有效区分药物溶液剂和脂质体制剂，而在EpiSkin模型中，2种剂型无明显差别。由此可看出在药物早期研究中，PVPA模型是比EpiSkin模型更加有效简便的预测药物渗透性的模型。为了考察PVPA膜的完整性，一般通过测量膜电阻和水溶性钙黄绿素的渗透率来表征。电阻过低和钙黄绿素的渗透率过高都提示膜的完整性可能被破坏。
PVPA模型不仅模拟角质层的脂质组成，还应用脂质体来模拟角质细胞的结构和形态特征，从而更好地模拟角质层。但目前PVPA模型与人皮的相关系数r2尚未见报道。
2.PVPA人工皮肤膜模型的制备方法与表征技术
2.1.制备方法
脂质体人工膜的制备需将脂质混合物覆盖在一个支撑性的膜材上。目前主要通过离心冻融法来制备。PVPA人工膜的制膜方法以及所需材料见表1。PVPA模型目前也没有进入市场，但Flaten等[16]在PVPA模型的制备自动化方面进行了探索，设计了一款热压装置(The IBR Heat-Press HP80-3500)，可以一次性将滤膜与24个transwell小室进行热压。
表1脂质人工皮肤膜的制备方法
模型 | 方法 | 滤膜材质及孔径 | 脂质成分 | 渗透装置 | 参考文献 |
PVPA | 离心冻融法: 先制备装有滤膜transwell小室和大小两种粒径脂质体，然后用离心的方法使脂质体沉积在滤膜表面，先零下70℃冷冻，再30℃加热干燥 | 混合纤维素膜，0.65μm | 卵磷脂、 神经酰胺类似物、胆固醇、 棕榈酸、胆固醇硫酸酯 | Traswell24孔嵌套板 | [11-14] |
2.2 表征技术
在研究脂质体人工皮肤膜的结构和特点的实验中，主要包括两个方面，一是研究膜表面的形态结构；二是研究脂质体成分的理化性质。应用到很多表征技术，如傅里叶变换红外吸收光谱、小角X-射线散射、激光共聚焦扫描显微镜等。这些技术在脂质体人工膜中的应用见表2。从表2中可以看出，这些表征技术在PVPA模型中应用的较多。PVPA模型模拟角质层的结构特征则需要更多微观显微技术的表征。
表2 表征技术在不同脂质人工皮肤模型中的应用
人工皮肤模型 | 表征技术 | |||||
FTIR | SAXS /SAXD | CLSM | CRM | DSC | Millicell-ERS | |
PVPA | [17] | [17] | [17,18] | [19] | [13] | [7,12-13] |
2.2.1傅里叶变换红外吸收光谱傅立叶变换红外光谱
(Fourier transform infrared，FTIR)仪被称为第三代红外光谱仪，利用麦克尔逊干涉仪将两束光程差按一定速度变化的复色红外光相互干涉，形成干涉光，再与样品作用。探测器将得到的干涉信号送入到计算机进行傅立叶变化的数学处理，把干涉图还原成光谱图。取适量的样品均匀的涂在ZnSe窗口，在数据采集前样品需干燥，在设定好波长和温度后，在程序升温过程中进行波段扫描，得到的图谱应用相应的软件绘制成伸缩峰-温度曲线或摇摆峰-温度曲线。从曲线中波数的变化可以观察分子结构中一些特殊官能团的变化，以及膜的相转变温度[18,20]。
2.2.2小角X-射线散射/衍射
当X射线照射到试样上时,如果试样内部存在纳米尺度的电子密度不均匀区，则会在入射光束周围的小角度范围内（一般2θ≤6）出现散射X射线，这种现象称为X射线小角度散射或小角度X射线散射。该技术可用来研究脂质体混悬液和膜屏障中脂质的晶格结构以及屏障的水合过程。将样品均匀的置于样品板内,用玻璃片轻压,将制备好的样品放入主机样品台上,按设定好的参数进行扫描。Flaten等[21]比较了脂质体混悬液和PVPA膜的SAXS曲线,发现两者在相同的位置出现尖锐的峰,说明PVPA膜表面还保留着脂质体的脂质双分子层结构,这些脂质体相互堆叠,使膜具有多层脂质结构。
2.2.3激光共聚焦扫描显微镜
激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM)是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针,利用计算机进行图像处理。与传统光学显微镜相比,它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图像等优点。Fischer等[22]制备了含有少量罗丹明B修饰的荧光磷脂的PVPA膜，将该膜从嵌套版上完整取出、置于载玻片上、加固定液固定、加盖玻片、置于CLSM下扫描。可观察膜的结构特征以及脂质成分在囊泡中的转移，但该方法的局限性是必须用荧光标记。
2.2.4共聚焦拉曼成像
共聚焦拉曼成像(confocalRamanmicroscopy,CRM)技术不需要荧光标记物就可以成像，可以选择有关分析所感兴趣的任何样品的任意部位，整个分析鉴定过程都非常直观,易于进行观察和控制。Gantzsch等[19]利用该技术对脂质体在PVPA膜表面、滤膜孔隙以及膜的完整性进行深入观察,证明先加入的小粒径的脂质体部分进入到滤膜的孔隙中。
2.2.5 差示扫描量热仪
差示扫描量热分析(differentialscanning calorimeter，DSC)是在程序控制温度下，测量输入到试样和参比物的能量差随温度或时间变化的一种技术。DSC所需的样品量非常少，可以是固体，也可以是液体，一般几到几十毫克即可。在测试时，取适量样品放入样品盘中，盖上盘盖，用压片机压紧，选择与样品盘相同的参比盘，用压片机压紧，用镊子将参比盘放在里面的测试台上，将样品盘放在外面的测试台上，然后按照设定好的升温程序进行测定。Flaten等[13]用DSC测定膜的相转变温度，考察药物分子与膜的相互作用，发现柳氮磺胺吡啶和萘普生使膜的相变温度发生改变，可能是药物分子与磷脂分子链头部基团发生相互作用。
2.2.6细胞电阻仪
Millicell-ERS电压电阻表,又名Millicell-ERS伏特欧姆计。该套设备主要由电阻测量仪和测量电极组成，用于测量Millicell插入式细胞培养皿中的细胞膜电压和跨上皮细胞电阻。Flaten等用它来测定PVPA膜的电阻值来考察膜的完整性,且发现膜的电阻值越大,药物的渗透系数越小。
3.结语与展望
众所周知，经皮给药是中医药除口服以外最主要的给药途径，内病外治是传统中医药的重要治疗方法，经皮给药具有给药方便、可随时中止用药、能够避免口服给药的胃肠道副作用及首过效应等优点。虽然中药外用具有确切疗效，但由于其组方成分复杂且不明确、给药剂量高，严重限制了高质量的现代外用制剂的研究开发。近年来不断有新技术应用到经皮给药系统中，如脂质体微针技术、微透析技术等。而脂质人工皮肤膜具有可塑性强、方便、高通量等优点，在经皮给药制剂的前期研究和处方筛选中的应用越来越受到科研工作者的关注。国内有关人工皮肤膜用于透皮实验的研究非常少，壳聚糖膜、硝酸纤维素膜曾被应用到药物体外透皮研究中，但都存在制备工艺较粗糙、缺少评价指标、缺少表征技术等问题。应向国外一些先进的研究机构学习，人工皮肤膜的制备和质量控制方面还有待进一步标准化，如形成标准的工艺流程、制定质量标准，从而相继发展形成大规模的商业化生产。
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3. 设计方案和技术路线
一、研究方案1.薄膜分散法制备不同比例的复合磷脂脂质体，探头超声控制粒径；2.用尼龙膜和复合脂质体制备脂质体人工皮肤膜；3.测定脂质体人工皮肤膜的电阻，比较不同比例复合磷脂脂质体的电阻大小；4.采用紫外分光光度法测定含不同比例氢化大豆磷脂的复合磷脂当中的卵磷脂氧化指数，筛选稳定性能较好的比例；5.将装好皮肤、脂质体人工皮肤膜的扩散池放入透皮扩散仪，配置一定的供给液及接受液，进行渗透实验，将各时间点取的接收液离心，取上清液进行HPLC测定，筛选渗透性能最与真皮接近的复合磷脂比例，从而优化脂质体人工皮肤膜组成。
二、技术路线1.薄膜分散法制定不同处方制备复合磷脂脂质体；2.进行稳定性考察，设计氧化实验并用紫外吸收法测定氧化指数；3.制备复合磷脂脂质体人工皮肤膜并测定其电阻；4.进行渗透性实验，筛选性能最优且与真皮最为接近的复合磷脂脂质体人工皮肤膜。
4. 工作计划
（一）、准备阶段（2022年1月-2月）
1、确定选题，制定课题研究实验方案，完成课题方案的开始实践论证；
2、查阅文献进行探讨研究，了解脂质体人工皮肤膜的研究进展及改进着手点；
5. 难点与创新点
目前文献报道的人工皮肤膜主要是借助于简单的改性技术制备,与真实皮肤的拟合度较低,直接导致体外透皮实验结果可信度不高。而研究发现脂质体与皮肤脂质有很好的相容性，可基于脂质体技术,模拟皮肤角质层的组成和结构,并通过脂质体融合改性人工膜，但因为该膜脂质体组成是蛋黄卵磷脂和胆固醇，其稳定性不高。复合磷脂脂质体是近年来涌现的一项新兴技术，其特点是在制备过程中采用两种不同相变温度的磷脂为膜材（一种高于常温，一种低于常温），加入高相变温度磷脂材料后会影响到脂质体的刚性，不同比例的磷脂材料在一定范围内的变化影响复合磷脂脂质体的刚性。所以本实验将在原脂质体处方中加入不同比例的氢化大豆磷脂，制备复合磷脂脂质体，从而考察其对膜电阻、渗透性能以及抗氧化能力的影响。致力于研发一种重现性好稳定性高且能模拟真实皮肤的人工皮肤膜,能够替代动物皮肤在体外透皮试验中的应用。
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