海滨雀稗全长cDNA文库的构建与质量检测开题报告

 2023-02-12 04:34:49

1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)

cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模版,逆转录形成的互补DNA与适当的载体连接后转化受体菌形成的重组DNA克隆群。

cDNA文库的构建是研究不同发育阶段和特定时期的基因表达、分离组织特异性基因以及克隆新型细胞因子的有利工具。

由于cDNA 文库是生物体在特定发育时期转录的全部mRNA经反转录而成的cDNA 片段与载体连接形成的克隆的集合,故不含有内含子[1-4]。

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2. 研究的基本内容和问题

研究的目标:构建海滨雀稗全长cDNA文库内容:采用Gateway方法构建海滨雀稗全长cDNA文库拟解决关键问题1、 高纯度mRNA的提取:保证mRNA纯度是保证成功构建全长高质量cDNA文库的重要条件。

初提mRNA时,会混有大量tRNA以及rRNA及少量蛋白质,故要进行进一步的处理,以获得高纯度的mRNA。

另外,由于唾液及汗液中会有大量mRNA的降解酶,在提取mRNA时,要佩戴手套及口罩。

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3. 研究的方法与方案

一、研究方法:取海滨雀稗叶片,研磨后,用 Trizol 法提取Total RNA,从Total RNA中分离出mRNA, 反转录出cDNA,用Gateway方法构建海滨雀稗cDNA文库。

全长cDNA文库的构建:参照Superscript Full length library construction kit II说明书进行。

二、技术路线:(见附件)三、 实验方案(见附件)四、可行性分析:国内外有很多方法构建全长cDNA文库,如CAPture 法、SMART 法、Oligo-capping法,Cap-trapper 法等等,本实验采用Gateway法构建全长cDNA文库,采用 Trizol 法提取Total RNA,进一步保证实验结果的精确性与准确性。

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4. 研究创新点

国内首次以海滨雀稗为材料构建cDNA文库,并通过构建cDNA文库为海滨雀稗耐盐性的分子生物学及基因组学研究奠定了坚实的基础。

采用Gateway 方法构建海滨雀稗cDNA文库不需要用传统酶切克隆,减少了因为非特异性酶切所造成的实验误差。

5. 研究计划与进展

2013.6-2013.12:海滨雀稗材料的培养、相关试剂准备及文献查阅2014.1-2014.4:RNA提取,mRNA纯化,全长cDNA文库构建2014.4-2014.6:文库浓度检测及PCR检测

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