川芎-冰片配伍对皮层缺血再灌注的协同保护作用机制研究开题报告

1.实验目的：研究川芎-冰片配伍对皮层缺血再灌注协同保护作用机制研究

2.实验材料：

（1）SD雄性大鼠54只（250-300g），分6组，每组9只。

（2）川芎水煎液提取：按1.0g/kg药材，每日11g药材。7日80g。

100g药材加500mL水，煮开，过滤。滤渣再加500mL水，煮开，过滤。合并滤液，浓缩至500mL，ig，0.5mL/100g。

（2）冰片的配制：0.08g/kg组：0.8g冰片用液体石蜡配到10ml，给药体积0.1ml/100g。

（3）尼莫地平片的配制：2片（60mg）用NS配至30mL，取27mL（即54mg），用NS稀释至36mL。ig，1ml/100g。

（4）酶标仪，型号:Synergy HT 厂家：美国伯腾仪器有限公司。离心机，型号：TG-16W 厂家：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

3.实验方法

3.1. 全脑缺血再灌注（GCIR）大鼠造模、分组和给药方法

取雄性健康大鼠，采用Pulsinelli法略加改良制作大鼠四动脉阻断型GCIR损伤模型。麻醉大鼠，颈正中切口并分离双侧颈总动脉。颈背部正中切口，分离肌层，暴露第一颈椎横突翼孔，直视下电凝其下通过的椎动脉，使双侧椎动脉永久闭塞。术后大鼠缝皮回笼。24h后用无创小动脉夹夹闭双侧颈总动脉，造成全脑缺血。缺血20min，松开动脉夹再灌注。缺血及再灌注期间用红外线测温仪监测耳内鼓膜温度，并使之维持在37℃0.2℃。按照Pulsineli报道确定模型成功标准：①双侧颈动脉夹闭后1 min 内动物意识丧失；②眼球变白，双侧瞳孔散大，对光反射消失，角膜反射消失或迟钝，但睫毛反射可存在；③翻正反射消失；④自主呼吸加快；⑤毛发竖起； ⑥小便失禁。凡不符合上述标准者或再灌注期间出现全身强直、抽搐等异常反应或死亡者全部废弃，不作为实验对象。取造模成功大鼠，随机法分为5组，每组10只（见下表）。另设假手术组10只，仅暴露双侧颈总动脉和翼小孔，不作缺血处理。各组连续灌胃给药7天，期间每日进行一般行为学检测（分泌物，体温、毛发、呼吸频率等），7天后进行下述指标检测：

3.2微透析手术方法

取雄性SD大鼠，麻醉后用脑立体定位仪将大鼠固定，剔除大鼠脑部的毛发，剪开皮肤，剥离皮下组织直至出现脑壳，皮层的脑区坐标（AP 3.2 mm, ML 0.8 mm, DV -3.0mm），在脑壳投射部位，用记号笔做上标记，并用牙科钻将该点打穿，植入微透析探针导管。导管植入后，将义齿基托聚合物型Ⅱ倒在大鼠头部，以固定导管。手术结束后大鼠单笼饲养。

表一、动物分组和处理方法

3.3指标测定方法

3.3.1脑区的兴奋性和抑制性氨基酸含量测定

乙醚麻醉，大鼠植入微透析探针（MAB7.8.10，膜厚度4 mm，截留分子量15 kDa），Microbiotech公司探针连接到微透析系统（瑞典CMA公司），配备CMA /100 μl微量注射器、导向管和动物监测笼。探针灌注人工脑脊液（Artificial cerebrospinal fluid，ACSF，配方为KCl：2.5 mmol/L；NaCl：125mmol/L；MgCl₂6H₂O：1.18 mmol/L；CaCl₂2H₂O：1.26 mmol/L；NaH₂PO₄H₂O：0.5 mmol/L；Na₂HPO₄2H₂O：5 mmol/L），在整个实验期间保持2.0 μL/mim的流速。整个系统稳定1.5小时后皮层脑区进行微透析，透析液于-80C存储。微透析完毕后，取脑于福尔马林固定，组织学检查以确定探针位置是否正确，如不正确，则该样本不计。待样本收集完后，用GC-MS检测兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸含量。

3.2.2其他指标测定

氨基酸收集完毕后，取下完整大脑，正中矢状面切开，分离得左右两个大脑半球。将两侧大脑半球分离出皮层脑区，分别用于下面蛋白表达和钙离子浓度检测。

（1）自噬相关蛋白的检测

采用Western blot法检测自噬相关蛋白（LC3 B/A、Beclin 1、BNIP3）的表达。具体方法为取右侧皮层组织0.5 g，细胞裂解，离心，行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电转移蛋白至硝酸纤维素膜上，用含5% SkimMilk的TBST（10mol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20）封闭，一抗采用兔抗大鼠上述蛋白抗体；二抗采用辣根过氧化物酶标记，增强化学发光法（ECL）显色，凝胶成像系统进行成像、分析。

（2） 脑片钙离子浓度检测

1）脑片制备

参照文献方法，大鼠断头，迅速取脑，浸入0℃预先饱和混合氧气（95% O₂ 5%CO₂）的ACSF。分离出皮层脑区组织后，经振动切片机制成400 μm厚的脑片，移入ACSF中室温下恢复孵育90 min。

2）激光共聚焦检测皮层脑区神经细胞内Ca² 浓度

脑片在37℃下含Fluo-3/AM（10μmol/L）的ACSF中孵育30 min后，选择在3-5 min保持荧光值稳定的皮层脑区神经元进行监测，检测时使用双激发单发射的方式进行扫描，双激发波长分别为340 nm和380 nm，发射波长为505 nm，细胞内游离Ca² 浓度由2种波长荧光强度的比值（F340/F380）反映。

第一阶段：2022.1-2文献综述，思路形成，制定实验方案；

第二阶段：2022. 3-4进行初步实验以及实验条件的摸索；

第三阶段：2022.4-5进行实验研究；

第四阶段：2022.6整理数据，撰写论文。