1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一般植物要完成种子萌发、生长、开花、结实等生长发育过程，需要充足的水分、矿物质营养，适宜的光照、温度和足够的氧气等环境条件。然而在自然条件下，植物往往会受到干旱、盐碱、低温等不利环境条件的胁迫危害，从而使植物的正常生长发育受到不同程度的影响，甚至导致植物死亡。这些非生物胁迫已经成为农业生产、生态环境改良、实现可持续发展的重要限制因素。因此，研究植物在非生物胁迫下的应答机制，应用基因工程的手段来提高植物抵抗逆境胁迫的能力具有重要的意义。本课题拟从抗寒性强的冷季型草坪草草地早熟禾中自主克隆DREB/CBF基因，用于植物的抗逆性和基因工程育种研究。
DREB/CBF是一类与逆境胁迫相关的转录因子，属于AP2/EREBP转录因子家族，具有保守的AP2/EREBP结构域(Okamuro etal., 1997；Jaglo et al., 2001)。它能特异性地结合DRE/CRT元件，调控启动子中含有DRE/CRT元件的一类逆境应答基因的表达，增强植物对多种逆境的抵抗和适应能力。许多研究结果表明，超表达DREB/CBF可提高拟南芥对冷、干旱和高盐胁迫的耐受能力(Liu et al., 1998；Jaglo et al., 1998, 2001)；组成型表达DREB1/CBF基因可以在没有冷胁迫的情况下诱导COR基因表达，提高了转基因植株的抗寒性；超表达CBF基因的拟南芥植株比野生型和没有经过冷适应的转基因植株积累了更多的代谢保护物（可溶性糖类和脯氨酸），且抗寒性强(Gilmour et al., 2000；2004)；超表达CBF4 转录因子的拟南芥，激活了启动子区域中含有CRT/DRE元件的下游基因的表达，提高了转基因植株的抗寒性和抗旱性(Haake et al., 2002)。
培育植物品种主要通过野生植物驯化、杂交选育、诱变筛选、分子标记和基因工程育种等手段来实现。其中，基因工程技术可以打破物种间遗传物质横向转移的壁垒，为难度较大的植物抗逆性改良开辟了直接有效的途径。近年来，国内外学者利用分子生物学手段对植物抗逆性基因克隆、遗传转化和功能鉴定进行了卓有成效的研究。Hsieh等(2002)将含有CBF1基因的表达载体转入西红柿，引起转基因西红柿T1和T2耐寒性均强于野生型。Ito等(2006)以OsCBF转化水稻后，转基因植株脯氨酸和可溶性糖含量大幅度升高，抗寒、抗旱和抗盐等能力均提高。Al-Abed等(2007)将拟南芥CBF3基因导入玉米中，提高了玉米抗寒性的同时还使耐旱性和耐盐性也有所增强。在草坪草方面，Li等（2006）将CBF1/DREB1B基因导入中华结缕草后，植株抗低温能力增强；贺杰等(2006)通过农杆菌介导将拟南芥CBF1基因导入中华结缕草并表现出一定的抗寒性；吴关庭等(2005)将拟南芥CBF1基因导入4个高羊茅品种，获得的转基因植株抗逆性有所增强。
2. 研究的基本内容和问题
本课题采用同源克隆方法从抗寒的冷季型草坪草草地早熟禾中自主克隆DREB/CBF基因，获得DREB/CBF基因cDNA序列全长。
3. 研究的方法与方案
草地早熟禾DREB/CBF基因的克隆：以优良的抗寒性强的Midnight草地早熟禾品种为供体材料，经低温处理后，采集Midnight幼嫩叶片，分别采用Trizol RNA试剂盒（Invitrogen）提取总RNA；根据GenBank中已知的DREB/CBF基因编码的蛋白质保守区设计简并引物，RT-PCR扩增获取目的基因中间片段；采用Generacer试剂盒（Invitrogen）进行3-RACE和的5-RACE扩增获得目的基因3和5端；测序、序列拼接、同源性比对（BLASTx）。
DREB/CBF基因广泛存在于有花植物中，目前，已从高羊茅、多年生黑麦草等冷季型草坪草中克隆到了DREB/CBF基因(Tang et al., 2005； 任清，2005；Xiong et al., 2006；阳文龙，2006）。草地早熟禾是禾本科早熟禾属多年生草本植物，被誉为是世界上最抗寒的冷季型草坪草种，因此，从草地早熟禾中克隆DREB/CBF基因具有可行性。
4. 研究创新点
本课题创新之处是从禾本科冷季型草坪草草地早熟禾中克隆DREB/CBF基因。
5. 研究计划与进展
2013.092013.10，查找阅读相关文献，学习实验室基因克隆的基本方法并确定实验方案；
2013.102014.04，从抗寒草地早熟禾中克隆DREB/CBF基因；
2014.042014.05，撰写毕业实验论文，准备答辩。
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