小鼠卵巢颗粒细胞的体外培养和主要促凋亡蛋白的检测开题报告

研究的目标、内容和拟解决的关键问题

研究目标：

熟练掌握原代细胞培养和细胞凋亡检测的方法，为研究促凋亡蛋白在小鼠颗粒细胞凋亡中的功能和作用机制及发现颗粒细胞中的主要调控者奠定基础。

研究内容：

首先，对3-5天的小鼠注射PMSG促进卵泡成熟，并取出卵泡，在显微镜下分离颗粒细胞；

其次，对分离的颗粒细胞进行体外培养，探讨卵巢颗粒细胞体外原代培养条件及方法；

然后，对体外培养的颗粒细胞进行氧化应激处理，诱导凋亡，检测细胞凋亡、Caspase活性和主要促凋亡蛋白的表达。

关键问题：

1. 熟练掌握原代细胞的培养和细胞凋亡检测方法；

2. 熟悉细胞凋亡的相关理论基础，发现主要促凋亡蛋白的内在联系；

3. 熟悉科学研究的思路和方法，为发现颗粒细胞中的主要调控者奠定基础。

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

研究方法：

1.小鼠卵巢颗粒细胞的原代培养，确定颗粒细胞体外培养的最佳条件

对3周龄小鼠注射PMSG使其发情，获得卵泡，在显微镜下分离颗粒细胞, PBS洗涤，过滤，细胞放在装有小牛血清（10%）的DMEM/F-12培养液中，在5%CO2培养箱中进行培养。

2. 确定小鼠颗粒细胞体外凋亡的最佳浓度

利用不同浓度的过氧化氢对小鼠卵巢颗粒细胞进行处理，使其产生凋亡，利用TUNEL法检测细胞凋亡，确定最佳浓度。

3.检测小鼠颗粒细胞凋亡过程中的主要促凋亡蛋白

分别用Real-time PCR和Western blotting技术，检测Trail、Bim等主要蛋白的表达。

4检测细胞凋亡的下游反应-Caspase活性

在原代培养颗粒细胞中，用Western Blot方法检测Caspase3,8,9变化。

技术路线：

实验手段及关键技术：

1.小鼠卵巢颗粒细胞的原代培养。

对3周龄小鼠注射PMSG使其发情，获得卵泡，在显微镜下分离颗粒细胞, PBS洗涤，过滤，细胞放在装有小牛血清（10%）的DMEM/F-12培养液中，在5%CO2培养箱中进行培养。

2.用不同浓度的H2O2处理小鼠颗粒细胞，其浓度为50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L

3. 细胞凋亡的检测

用Roche Applied Science公司生产的原位检测细胞凋亡的试剂盒检测凋亡。

4.Real-Time PCR和Western Blot

Real-Time PCR：提取RNA, 反转录cDNA，反应，收集数据；

Western Blot：上样，电泳，转膜，封闭，一抗孵育，二抗孵育，显色，曝光。

可行性：

1. 有充足的理论支持

颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的主要原因。

2. 技术上的可行性

本研究中涉及的技术方法，如细胞培养、细胞凋亡检测、Western Blot等技术实验室的常规技术，本研究不存在技术上的障碍。

特色或创新之处

1. 建立小鼠卵巢颗粒细胞原代培养的方法，澄清目前研究中的问题；

2. 参与颗粒细胞凋亡的蛋白和信号分子主要有60多个，但是尚未发现主要调控者，为发现参与颗粒细胞凋亡的主要调控者奠定基础。

研究计划及预期进展

2013.05-2013.07：查阅研究课题相关资料，撰写综述，确定研究方案；

2013.09-2013.11：小鼠卵巢颗粒细胞的分离和体外培养条件的优化；

2014.12-2013.01：诱导小鼠颗粒细胞凋亡的浓度确定；

2014.03-2014.04：检测小鼠颗粒细胞凋亡过程中的主要调控蛋白；

2014.05-2014.06：检测细胞凋亡下游Caspase活性和撰写毕业论文。