1. 研究目的与意义
动物药材是祖国医药重要组成部分，应用历史悠久，具有资源广、活性强、疗效高、效益大等特点，临床上广泛用于治疗疑难杂证、急重病证。由于动物药材特别是多来源品种较为混乱，而且大部分为贵重紧缺药材，通常多以粉末、中成药等形式入药，外部形态不完整或被破坏，混伪品增多，给动物药材的准确鉴定带来了极大的困难。中药材传统鉴定法（基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定）对多来源药材、破碎药材、粉末药材以及中成药的鉴定有一定的局限性，动物药材特别是名贵珍稀动物正品难以澄清，制约了中药事业的大力发展，更使人民的生命安全受到了极大的威胁。
本项目针对国内中药材市场上珍贵稀有动物药材蟾蜍存在伪品现象，开展DNA条形码技术快速鉴别上述动物药材及其混伪品、近缘物种的技术研究。通过对收集的动物中药样本COI序列进行测定，在Genbank库中进行Blast分析，构建NJ系统树，计算K2P（Kimura 2 -parameter）遗传距离，探讨DNA条形码对上述动物中药及其混伪品的识别鉴定特性，研制DNA条形码检测技术，构建上述相关生物物种的基因条形码标准数据库，建立我国重要生物遗传资源的DNA条形码网络服务体系及基于DNA条形码技术的快速检测方法和分类平台。项目的开展有利于我国珍稀动物中药材市场的规范化建设和贸易监管，具有良好的示范应用价值。
研究内容主要包括：
2. 文献综述
关于鉴定蟾蜍混伪品的DNA条形码技术综述
摘 要 动物药材是我国中医药的重要组成部分，临床上广泛用于治疗疑难杂症、急重病症。但由于动物药材特别是多来源品种较为混乱，且大部分为贵重紧缺药材，动物药材特别是名贵珍稀动物正品难以澄清，制约了中药事业的大力发展，更使人民的生命安全受到威胁。为此，科技部建立科研专项探索鉴定方法，本项目为其中项目之一，针对国内中药材市场上珍贵稀有动物药材蟾蜍类药用部位药材存在伪品现象，开展DNA条形码技术[[1]]快速鉴别上述动物药材及其混伪品、近缘物种的技术研究，本文对利用DNA条形码技术对动物药材蟾蜍及其混伪品的鉴别技术进行探讨与总结。
3. 设计方案和技术路线
线粒体COI基因被公认为动物界中标准的DNA条形码基因。该序列种间变异能较好地区分除刺胞动物门以外的物种，并且COI在能够保证足够变异的同时又很容易被通用引物扩增，很少存在插入和缺失。基于COI基因的动物类中药的DNA条形码技术建立和推广应用，有利于实现中药鉴定客观化、规范化、标准化。目前尚未见有基于COI基因条形码技术的蟾蜍药材分子鉴定的相关文献报道。本项目拟利用DNA条形码COI序列对蟾蜍及其混伪品进行鉴别研究，通过对样品标准序列进行测序，建立DNA条形码数据库，构建动物药材DNA条形码分子鉴定的标准平台，实现蟾蜍及其混伪品的标准化鉴定和信息数据共享，确保药材的质量及临床疗效。
①创新适合的动物药材DNA提取方法
②建立完善的动物药DNA条形码鉴定技术规范
4. 工作计划
起 | 2022.06 | 样品采集、试剂盒购置；对全蝎、蟾酥的主要产地、市场价格、市场混伪情况进行调查，设计实验方案 | 收集样品，建立 DNA 条形码鉴定平台 |
止 | 2022.12 | ||
起 | 2022.01 | 技术培训，样本处理，DNA提取， 测序工作 | DNA 条形码鉴定人才队伍培养；制定 DNA 条形码鉴定技术规范 |
止 | 2022.6 |
5. 难点与创新点
线粒体COI基因被公认为动物界中标准的DNA条形码基因。该序列种间变异能较好地区分除刺胞动物门以外的物种，并且COI在能够保证足够变异的同时又很容易被通用引物扩增，很少存在插入和缺失。基于COI基因的动物类中药的DNA条形码技术建立和推广应用，有利于实现中药鉴定客观化、规范化、标准化。目前尚未见有基于COI基因条形码技术的和蟾蜍药材分子鉴定的相关文献报道。本项目拟利用DNA条形码COI序列对蟾蜍及其混伪品进行鉴别研究，通过对样品标准序列进行测序，建立DNA条形码数据库，构建动物药材DNA条形码分子鉴定的标准平台，实现蟾蜍及其混伪品的标准化鉴定和信息数据共享，确保药材的质量及临床疗效。
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