1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）
{title}文 献 综 述1、抗生素与抗生素抗性基因抗生素是指由细菌、真菌以及放线菌属等微生物或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物[1]。
从来源上看，抗生素可分为天然、半人工合成和人工合成[2]。
目前已经被发现或合成的抗生素达上万种之多[3]。
医疗和畜牧业长期过度使用抗生素，尤其是滥用抗生素促使其在环境微生物中发展和传播，加速了抗生素抗性基因( antibiotic resistance genes, ARGs)和多重抗性基因的出现和传播[4]。
ARGs是微生物，包括病原微生物，是形成抗生素抗性和传播的物质基础。
抗生素抗性基因兼具可自我复制和传播扩散的生物特性与不易消亡和环境持久的物化特征,可在不同细菌间横向转移甚至自我扩增,导致微生物耐药性快速扩散,被认定为一种新型环境污染物[5] 。
2、抗生素抗性基因污染成因及现状抗生素抗性基因污染在全球各地均引起重视[6-8]。
抗生素的滥用是抗性基因污染出现的关键所在。
人类活动排放的抗生素和抗生素抗性基因（ARGs）主要是通过废污水排放以及养殖活动进入环境[9]。
抗生素抗性基因广泛存在于水体[10]、空气[11]和土壤[12]等各种环境中，其中水体和土壤中的抗性基因污染对人类影响最大。
宋等[13]对东洞庭湖表层水体的研究表明，其受到磺胺类、四环素类、大环内酯类和喹诺酮类抗性基因的共同污染，检出率为100%，尤以前两者为重，检出的抗性基因浓度范围分别为3.7~3.16103 copies/mL、2.69~2.43copies/mL。
陈等[14]对再生水补给型城市景观水体圆明园的研究中，ARGs的绝对丰度依次为sulII＞sulI＞mefA＞tetQ＞tetM＞ermB，sulII在检测ARGs中占据主导地位，其绝对丰度为3.15105~1.08109copiesL-1。
而圆明园内景观用水均来自于清河污水处理厂处理后的再生水，说明现有的污水处理工艺对抗生素的处理效果有限。
禽畜粪便和有机肥等是ARGs和ARB（antibiotic resistance bacteria）进入土壤的重要途径，李森[15]对东北黑土农田抗生素抗性基因污染进行调查研究发现，农田土壤中ARGs的绝对丰度为2.59107~4.14108copiesg-1soil，施用有机肥增加了土壤中ARGs的绝对丰度，多重耐药类达到85%。
土壤中的ARGs通过不同方式进入植物中[1],抗性基因在水环境、土壤中的研究已经很普遍，但针对植物微生物中ARGs的研究并不多，然而植物中的抗性基因可能会对人体健康造成潜在的威胁，应该给予足够的重视。
3、胞内抗性基因和胞外抗性基因细胞外和细胞内的抗生素抗性基因( extracellular antibiotic resistance genes，eARGs和intracellular antibiotic resistance genes ，iARGs )共同构成环境中的整个抗性基因组[16]。
过往的研究常常着重于胞内抗性基因，忽视了胞外抗性基因。
但是研究表明，胞外抗性基因广泛存在于环境中，其丰度不低于甚至高于胞内抗性基因[17]。
eARGs可通过自然转化感染非耐药菌，进而导致耐药性进一步扩散;而细胞DNA中的iARGs可以通过自我复制(垂直基因转移，lateral gene transmission，LGT)传递给下一代，也可以通过接合(细胞-细胞接触)或转导(噬菌体感染)传递给其他细菌物种[18]。
转化（transformation）、接合(conjugation)和转导(transduction)是水平基因转移(horizontal gene transfer，HGT)的三种主要机制，是ARGs在细菌中增殖的主要原因[19]。
胞外抗性基因胞外抗性基因可能以不同的物理形态存在，如游离于水中（游离型胞外抗性基因(f-eARG)）或结合于其他固体颗粒（结合型胞外抗性基因(a-eARG)），其抗逆性和水平转移风险可能存在极大差异[20]。
4、抗性基因在植物中的迁移传播植物是人类赖以生存的资源之一，土壤中或者灌溉用水内含有ARGs都可能使ARGs富集于植物中，对人类的健康造成隐患。
植物吸收抗生素主要包括以下几个途径：（1）植物根部对抗生素的直接吸附作用；（2）植物根系对抗生素的吸收，向地上组织进行运输转移以及体内降解；（3）通过根系分泌物和相关微生物对抗生素的降解[21-22]。
研究表明，不同植物以及同一植物的的不同位置抗生素的含量均有所不同[23]。
王娜[23] 通过研究环境中磺胺类抗生素及其抗性基因污染得出，大部分抗生素都被检到残留于植物茎叶，植物组织中四环素和磺胺二甲密啶的浓度在1~50ng/g之间，残留水平与暴露时间和粪便中抗生素的含量成正比。
Briggs等[24]提出了一个简单的模型用于预测抗生素在植物中的富集量：LogSCF=AlogKow-B其中：SCF：抗生素在茎叶中浓度与在土壤中浓度的比值；A和B：常数（取决于植物种类和生长环境）。
抗生素在一般情况下表现为在高浓度时抑制植物生长，而在低浓度时对植物生长具有一定的促进作用[25]。
在土壤-植物系统中残留的ARGs/ARB/抗生素不但会对环境中微生物群落、动物和植物产生生态毒性，还极有可能会引起耐药性的传播。
5、总结本文介绍了抗性基因和其污染现状，综述了抗性基因的组成胞内抗性基因和胞外抗性基因，以及胞外抗性基因在植物中的迁移传播。
目前国内的相关研究集中于水环境和土壤中的抗性基因，但植物中也存在着大量的抗生素抗性基因，对人类的健康有着巨大的潜在威胁。
关于胞外抗性基因的研究在国内还处于起步阶段，所以需要进一步研究结合型或游离型胞外抗性基因在植物中的迁移传播规律，这对于促进我国环保事业有不小的帮助。
参考文献[1]黄伟杰,刘学智,唐红亮,汪义杰,陈军.植物修复在抗生素污染治理中的应用研究进展[J].生态科学,2022,41(01):222-229.[2] SINGER R S, FINCH R, WEGENER H C, et al. Antibiotic resistance-the interplay between antibiotic use in animals and human beings[J]. The Lancet Infectious Diseases, 2003, 3(1): 4751. [3] MARTINEZ J L. Environmental pollution by antibiotics and by antibiotic resistance determinants[J]. Environmental Pollution, 2009, 157(11): 28932902. [4]李金梅,梁威,张洪勋,余志晟.典型淡水环境中抗生素抗性基因的分布及其溯源[J].安全与环境学报,2021,21(05):2329-2336.DOI:10.13637/j.issn.1009-6094.2020.1231. [5]陈笑雪,王智源,管仪庆,陈求稳,黄玉,严晗璐,杜云彬,刘小华,刘超.淡水环境中抗生素抗性基因的来源、归趋和风险[J].生态毒理学报,2021,16(03):14-27.[6]T N Nguyen,I Kasuga,M Liu,H Katayama. Occurrence of antibiotic resistance genes as emerging contaminants in watersheds of Tama River and Lake Kasumigaura in Japan[J]. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science,2019,266(1):[7]Edo McGowan. Antibiotic Resistance Genes as Emerging Contaminants: Studies in Northern Colorado[J]. Environmental Science Technology: EST,2007,41(7):[8]杨沂嫡,梁永兵,李君文,金敏.我国生活饮用水抗生素耐药基因污染现状及其检测技术研究进展[J].中国公共卫生,2021,37(10):1575-1579.[9]张玲,白军红,梁金凤,王亚琪,魏卓群,杜书栋.基于CiteSpace文献计量的湖泊抗生素抗性基因研究进展与热点分析[J].环境科学学报,2022,42(01):308-320. [10]Syeda Maria Zainab,Muhammad Junaid,Nan Xu,Riffat Naseem Malik. Antibiotics and antibiotic resistant genes (ARGs) in groundwater: A global review on dissemination, sources, interactions, environmental and human health risks[J]. Water Research,2020,187(prepublish):[11]Yizhu Wang,Can Wang,Lu Song. Distribution of antibiotic resistance genes and bacteria from six atmospheric environments: Exposure risk to human[J]. Science of the Total Environment,2019,694(C):[12] Ondon Brim Stevy,Li Shengnan,Zhou Qixing,Li Fengxiang. Sources of Antibiotic Resistant Bacteria (ARB) and Antibiotic Resistance Genes (ARGs) in the Soil: A Review of the Spreading Mechanism and Human Health Risks.[J]. Reviews of environmental contamination and toxicology,2021:[13]宋冉冉,国晓春,卢少勇,刘晓晖,王晓慧.东洞庭湖表层水体中抗生素及抗性基因的赋存特征与源分析[J].环境科学研究,2021,34(09):2143-2153.[14]陈惠鑫,佟娟,陈奕童,程荣,郑祥.再生水补给型城市景观水体中抗生素抗性基因的污染特征以圆明园为例[J].环境科学学报,2019,39(12):4057-4063.[15]李森. 东北黑土农田抗生素抗性基因污染及调控研究[D].中国科学院大学(中国科学院东北地理与农业生态研究所),2021.DOI:10.27536/d.cnki.gccdy.2021.000006.[16]Zou Yina,Wu Menghan,Liu Jiayu,Tu Weiming,Xie Fengxing,Wang Hui. Deciphering the extracellular and intracellular antibiotic resistance genes in multiple environments reveals the persistence of extracellular ones[J]. Journal of Hazardous Materials,2022,429:[17]Yuan, Q.-B.; Huang, Y.-M.; Wu, W.-B.; Zuo, P.; Hu, N.; Zhou, Y.-Z.; Alvarez, P. J. J., Redistribution of intracellular and extracellular free L-1 TrisHCl中 20 gL-1,天根生物科技公司,中国)添加到5 mL的样品滤液中，并充分混合以去除杂质,再加入30 μL的磁珠备用液,颠倒混匀,在快速核酸提取仪涡旋震荡4 min后,将混合物置于磁力架上以沉淀磁珠并弃去上清液。
然后用1 mL的Buffer CW1(含有7 molL-1盐酸胍的50%异丙醇)洗涤磁珠,再次利用磁力架除去上清液。
接着用Buffer CW2(75%的乙醇)洗涤2次,在室温下放置10~15 min使残余的乙醇充分挥发。
将30 μL的Elution Buffer(pH 8.5,10 mmolL-1Tris-HCl,预热至55℃)添加至磁珠中震荡5 min。
最后将混合物置于磁力架上收集上清液用于DNA分析。
将获得的DNA采用Nanodrop和琼脂糖凝胶电泳验证。
2.1.3定量PCR检测对四种广泛存在的ARGs进行定量检测，进行定量检测,包括四环类抗性基因(tet A)、磺胺类抗性基因(sul1和sul2)和大环内酯类抗性基因(erm B),同时监测16S rDNA浓度以计算抗性基因的相对丰度。
4种抗性基因及16S rDNA 基因引物如表1所示。
定量PCR的步骤主要包括标准样品的制备﹑标准曲线的测定和样品中抗性基因绝对丰度的测定﹑数据分析。
首先，将高浓度的标准品进行10倍梯度连续稀释5个梯度作为标准曲线，在qPCR仪(AB17500，美国）上进行反应。
qPCR的测定采用20μL反应体系，其中包括10 uL2xSuperRealPreMix Plus (Tiangen Biotech，中国)，2 μL 50Rox染料（Tiangen Biotech，中国)，0.4 μL上下引物、6.2μL ddH2O以及1μL标准品。
反应条件为:95℃预热 15 min→40个扩增循环（95 ℃ 10 s，退火20s，64℃保持30 s)。
样品的测定步骤同标准曲线，并根据Ct值计算ARG拷贝数。
确保标准曲线的R2>0.99。
样品三组平行间偏差≤5%，所有样品的扩增效率在90%～110%之间。
表1 4种抗性基因及16S rDNA 基因引物目标基因 正向序列 反向序列 片段tetA GCTACATCCTGCTTGCCTTC CATAGATCCCGTCAAGAGG 210sul1 CACCGGAAACATCGCTGCA AAGTTCCGCCGCAAGGCT 158sul2 TCCGGTGGAGGCCGGTATCTGG CGGGAATGCCATCTGCCTTCAG 191ermB GATACCGTTTACGAAATTGG GAATCGAGACTTGAGTGTGC 36416SrDNA CCTACGGGAGGCAGCAG ATTACCGCGGCTGCTCG 1782.2结合型胞外抗性基因向植物传播的特征2.2.1 样品采集及其预处理取水培幼苗的根、茎、叶各1g，通过一定方法制作为样品。
2.2.2 样品结合型胞外DNA提取同2.1.3。
2.2.3定量PCR检测同2.1.4.。
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