1. 研究目的与意义
中国鸡文化源远流长，内涵丰富多彩。在有文字可查的历史中我国有3000多年的养鸡历史，是世界上最早养鸡的国家之一，也是最早发现鸡有药食两用的经济家禽。原产于中国的地方品种鸡资源也是极为多样化。中国历史上形成的许多优良鸡种不但造福了国内广大人民群众，亦被国外引入，甚至作为标准品种做成图鉴录入各国的家禽品种数据库中。例如在一百多年前我国的著名鸡种狼山鸡和九斤鸡被引入到英国、美国、德国和日本。此外，目前世界著名鸡种中，有的也是与我国的地方鸡种杂交而来。例如，澳洲黑鸡、黑澳品顿鸡、芦花洛克鸡和洛岛红鸡。可见中国的地方鸡种有充分的市场和经济价值，受到消费者的广泛喜爱。目前我国主要的地方鸡种有30种，具体如下表（表1，裴鑫德，1994）。但是，随着科技的进步和经济的发展越来越多的养殖基地选择不断地引进国外快大型鸡与本地鸡种杂交筛选希望最终能找到集各种鸡优点于一身的经济价值高的杂交鸡，可是这也带来了一系列的问题。影响了我国的鸡资源的生物多样性，甚至农科院不得不建立起地方鸡种基因库加以保护。除此之外，许多不法商贩利用消费者偏爱地方特色鸡种的心理，将普通肉鸡的鸡肉标成地方特色鸡种并高价出售，不但损害消费者权益而且破坏市场秩序。对此，利用现代生物学技术对市场现状进行调查现状、分析和研究鸡的生物多态性最后甚至能建立出一套快速高效的鉴别方法来甄别某些特色鸡种显得很有必要。
表1 30种地方鸡种
Table 1 30 common chicken breeds
编号 | 品种 | 编号 | 品种 | 编号 | 品种 |
1 | 仙居鸡 | 11 | 边鸡 | 21 | 杏花鸡 |
2 | 白耳黄鸡 | 12 | 彭县黄鸡 | 22 | 霞烟鸡 |
3 | 狼山鸡 | 13 | 林甸鸡 | 23 | 河田鸡 |
4 | 大骨鸡 | 14 | 峨眉黑鸡 | 24 | 中原斗鸡 |
5 | 北京油鸡 | 15 | 静原鸡 | 25 | 吐鲁番斗鸡 |
6 | 浦东鸡 | 16 | 溧阳鸡 | 26 | 西双版纳斗鸡 |
7 | 寿光鸡 | 17 | 武定鸡 | 27 | 福建丝羽乌骨鸡 |
8 | 萧山鸡 | 18 | 桃源鸡 | 28 | 江西丝羽乌骨鸡 |
9 | 鹿苑鸡 | 19 | 惠阳胡须鸡 | 29 | 茶花鸡 |
10 | 固始鸡 | 20 | 清远麻鸡 | 30 | 藏鸡 |
2. 文献综述
我国市场常见鸡肉亚种的遗传多态性与分子鉴别技术研究
一、研究背景
编号 | 品种 | 编号 | 品种 | 编号 | 品种 |
1 | 仙居鸡 | 11 | 边鸡 | 21 | 杏花鸡 |
2 | 白耳黄鸡 | 12 | 彭县黄鸡 | 22 | 霞烟鸡 |
3 | 狼山鸡 | 13 | 林甸鸡 | 23 | 河田鸡 |
4 | 大骨鸡 | 14 | 峨眉黑鸡 | 24 | 中原斗鸡 |
5 | 北京油鸡 | 15 | 静原鸡 | 25 | 吐鲁番斗鸡 |
6 | 浦东鸡 | 16 | 溧阳鸡 | 26 | 西双版纳斗鸡 |
7 | 寿光鸡 | 17 | 武定鸡 | 27 | 福建丝羽乌骨鸡 |
8 | 萧山鸡 | 18 | 桃源鸡 | 28 | 江西丝羽乌骨鸡 |
9 | 鹿苑鸡 | 19 | 惠阳胡须鸡 | 29 | 茶花鸡 |
10 | 固始鸡 | 20 | 清远麻鸡 | 30 | 藏鸡 |
中国鸡文化源远流长，内涵丰富多彩。在有文字可查的历史中我国有3000多年的养鸡历史，是世界上最早养鸡的国家之一，也是最早发现鸡有药食两用的经济家禽。原产于中国的地方品种鸡资源也是极为多样化。中国历史上形成的许多优良鸡种不但造福了国内广大人民群众，亦被国外引入，甚至作为标准品种做成图鉴录入各国的家禽品种数据库中。例如在一百多年前我国的著名鸡种狼山鸡和九斤鸡被引入到英国、美国、德国和日本。此外，目前世界著名鸡种中，有的也是与我国的地方鸡种杂交而来。例如，澳洲黑鸡、黑澳品顿鸡、芦花洛克鸡和洛岛红鸡。可见中国的地方鸡种有充分的市场和经济价值，受到消费者的广泛喜爱。目前我国主要的地方鸡种有30种，具体如下表（表1，裴鑫德，1994）。但是，随着科技的进步和经济的发展越来越多的养殖基地选择不断地引进国外快大型鸡与本地鸡种杂交筛选希望最终能找到集各种鸡优点于一身的经济价值高的杂交鸡，可是这也带来了一系列的问题。影响了我国的鸡资源的生物多样性，甚至农科院不得不建立起地方鸡种基因库加以保护。除此之外，许多不法商贩利用消费者偏爱地方特色鸡种的心理，将普通肉鸡的鸡肉标成地方特色鸡种并高价出售，不但损害消费者权益而且破坏市场秩序。对此，利用现代生物学技术对市场现状进行调查现状、分析和研究鸡的生物多态性最后甚至能建立出一套快速高效的鉴别方法来甄别某些特色鸡种显得很有必要。
表1 30种地方鸡种
Table 1 30 common chicken breeds
二、材料与方法
DNA条形码（DNA barcoding）是指通过对标准目的基因的DNA序列进行分析从而对相关物种进行鉴别，这种鉴别方法既简便亦很快速，近年来得到广泛的应用。起初加拿大生物学家Hebert等（Hebert et al,2003）利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（cytochrome C oxidase Ⅰ,COⅠ）这一目标基因序列鉴别同属一个种类的2500 多只哥斯达黎加普通蝴蝶并将其分成10个不同的组别，并由此发展出了DNA条形码技术来鉴别不同的物种。此后很多专家在此基础上发展出了通过其他目的基因来鉴别物种，例如利用D-loop基因序列鉴别麝属动物的鉴别（ Yang C,2014 ）,还有专家利用了线粒体基因 cytochrome b 进行物种鉴别（Naue J，2014）。因此选择四种目的基因（Cyt b，COI，D-loop）作为备选，在以后正式实验中进行筛选出效果最佳的一个。
1.1 实验材料
1.1.1 供试鸡种 本研究10个鸡种样品（详见表2）为市场常见的鸡种并来自生活中容易购得的渠道，与市民日常生活息息相关，具有高度可识别性和代表性。
1.1.2 试剂 实验所用提取DNA的试剂盒为 TIANamp Genomic DNA Kit购自北京天 根生化科技有限公司,Premix Taq 和 2k bp DNA marker 均购自大连 TAKARA公司，核酸染料没有采用常见试剂溴化乙锭（EB），因为其强致癌性已被明确证明。采用了新型代替试剂GelStain采购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2 DNA提取方法按照天根试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit,离心柱型）所附操作说明书进行。 本课题选择此类型DNA提取试剂盒，主要因为柱式具有高效，提取率高等优点。（Jorge et al.,2007）
提取操作步骤 取肌肉组织20mg ，打碎去细胞悬液，裂解后将悬液转移到吸附柱内，通过提高盐浓度降低pH值，使未变性的DNA特异吸附在硅胶膜上，再加入试剂降低盐浓度，提高pH值将DNA洗脱下来。用分光光度计检测DNA浓度和质量，将浓度稀释至50ng/ml。
表2 10种不同来源的鸡种信息表
Table2 10 chicken breeds with original place.
编号 | 品种 Breeds | 原产地 Origin | 实际产地 Actual Sources From |
1 | 乌骨鸡 Black-bone | 江西太和Taihe county | 江苏南京Nanjing |
2 | 苏北麻鸡 Subei ma | 苏北North of Jiangsu | 江苏南京Nanjing |
3 | 三黄鸡 Sanhuang | 中国China | 安徽芜湖Wuhu |
4 | 黄羽肉鸡 Huangyu | 中国China | 安徽芜湖Wuhu |
5 | 淮南土鸡 Huainan tu | 安徽淮南Huainan | 安徽芜湖Wuhu |
6 | 火鸡 Turkey | 墨西哥Mexico | 北京Peking |
7 | 白羽鸡 White-feather | 美国USA | 山东Shandong |
8 | 北京油鸡 Peking fatty | 北京Peking | 北京Peking |
9 | 智利肉鸡 Chile | 智利Chile | 智利Chile |
10 | 河田鸡 Hetian | 福建河田Hetian Town | 福建河田Hetian Town |
1.3 引物设计
通过NCBI已发表的文献中搜集目标基因的通用引物（详见表3），同时，根据GenBank上发表的原鸡全序列（AP003322）的COI、Cyt b、D-loop的基因序列与其同属异种亲缘较近的灰原鸡（AP006746）、黑尾原鸡（NC_007239）通过软件DNAMAN进行序列比对，设计目标基因的通用引物（详见表3）。所有引物交由南京金斯瑞生物科技公司合成合成。
表3 引物信息表
Table3 Table with information for primers
编号 Code | 序列(5-3) Sequence(5-3) | 片段长度 Length | 来源 Source |
COI-1-F | TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA | 未知(Unknown) | O.Folmer et al,1994 |
COI-1-R | GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG | 未知(Unknown) | O.Folmer et al,1994 |
Cyt b-1-F | CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG | 1140bp | Kocher et al,1989 |
Cytb-1-R | GGAATTCATCTCTCCCGGTTTACAAGAC | 1140bp | Irwin et al,1991 |
CO I-2-F | GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG | 658bp | Herbert et al,2003 |
CO I-2-R | TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA | 658bp | Herbert et al,2004 |
D-loop-1-F | AGGACTACGGCTTGAAAAGC | 1236bp | E.J.Smith Et al,2007 |
D-loop-1-R | CATCTTGGCATCTTCAGTGCC | 1237bp | E.J.Smith Et al,2007 |
CO I-3U-F | GCGTGACCTTCATCAACCGATGATTAT | 1555bp | 本文研究 This study |
CO I-3U-R | CGCCTTTCTTGCACTTGTACAAAGGCT | 1555bp | 本文研究 This study |
Cyt b-2U-F | ATGGCACCCAACATYCGAAAATC | 1146bp | 本文研究 This study |
Cyt b-2U-R | CGCTTAGTAGTTGAGTATTTTGTTTT | 1146bp | 本文研究 This study |
D-loop-2U-F | CGAATTTTATTTTTTAACCTAACTCCC | 1233bp | 本文研究 This study |
D-loop-2U-R | TTTATAGTGGTAGAAGGCAGGTTTT | 1233bp | 本文研究 This study |
1.4 PCR扩增
1.4.1 引物筛选及反应条件优化
选取编号为1和2的样品，提取DNA，用表3中7对引物分别对其进行PCR扩增。
扩增的反应体系为50ml：超纯水19ml，Premix(Takara，大连)25 ml, 模板DNA4 ml，上游引物及下游引物各1 ml。反应条件：94℃预变性5min; 94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 循环；72 ℃延伸10 min。扩增反应使用ABI9700 PCR仪（applied biosystems，US）。
反应条件：反应条件：94℃预变性5min; 94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 循环；72 ℃延伸10 min。扩增反应使用ABI9700 PCR仪（applied biosystems，US）。
1.5 PCR产物纯化及测序
PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分析。分析合格后，回收PCR扩增产物，交由南京金斯瑞生物科技公司测序。若杂带较多，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）纯化DNA，再送检。
1.6 序列比对
利用软件DNAStar进行序列拼接校正（双向测序），对样品进行分类，找出各地方鸡种的特异性位点。并将序列用CLUSTALW软件进行比对（Hebert P D N，2003），用GenBank中原鸡序列进行对比。然后，用MEGA软件计算各鸡种的遗传距离，最终构建出进化系统树，直观展示出亲远及进化关系。
1.7 鉴别方法的研发
基于实时荧光定量核酸扩增检测系统（QPCR），最终开发出一套能快速，低成本的检测出某种地方特色鸡种的方法，除了能打击不法商贩的欺诈行为，维护市场秩序，甚至对于我国地方鸡种资源的保护也有一定的贡献。经过前人对食品安全的不懈追求，已开发出从混合肉制品中通过Taqman探针利用QPCR鉴别出普通鸡和火鸡的方法（Kesmen Z，2012）。基于此，对于符合我国国情及市场需求的QPCR方法的建立也显得尤为迫切。
References
Pei Xinde.(1994)Study of classification of chinese native chicken breeds.Biomath.,49-56
Hebert P D N, Penton E H, Burns J M, Janzen D H, Hallwachs W.(2004)Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly astraptes fulgerator. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,101(41):14812-14817.
Yang C1,Xiao Z,Zou Y,Zhang X,Yang B,Hao Y,Moermond T.(2014).DNA barcoding revises a misidentification on musk deer.Yue B.Mitochondrial DNA.
Naue J,Hansmann T.(2014)High-resolution melting of12SrRNA and cytochrome b DNA sequences for discrimination of species within distinct European animal families.Schmidt UPLoS One.9(12):e115575.
Jorge M. Tolosa, John E. Schjenken , Theodora D. Civiti, Vicki L. Clifton, and Roger Smith(2007).Column-based method to simultaneously extract DNA, RNA, and proteins from the same sample.BioTechniques 43:799-804 ,doi 10.2144/000112594
O.Folmer;M.Black;W.Hoeh;R.Lutz;R,Vrijenhoek.(1989).DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit from diverse metazoan invertebrates Mol.Mar.Biol.Biotechnol.,pp.194-299
Kocher TD, Thomas WK, Meyer A, Edwards SV, et al. (1989). Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 6196-6200.
Irwin DM, Kocher TD and Wilson AC (1991). Evolution of the cytochrome b gene of mammals. J. Mol. Evol. 32: 128-144
Hebert PD, Cywinska A, Ball SL and deWaard JR (2003). Biological identifications through DNA barcodes. Proc. Biol. Sci. 270: 313-321.
SmithEJ,ShiL,PrevostL,DrummondP,RamlalS,SmithG,PierceK,FosterJ.(2001)Expressed sequence tags for the chicken genome from a normalized, ten-day-old White Leghorn whole embryo cDNA library.J Hered2001;92:1-8.
Hebert P D N , Ratnasingham S, DeWaard J R. (2003)Barcoding animal life:cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings of the Royal Society of London Series B (Suppl.), 270: 96-99.
Kesmen Z1,Yetiman AE,Sahin F,.(2012).Detection of chicken and turkeymeatinmeatmixtures by using real-timePCRassays ,Yetim H.J Food Sci.77(2):C167-73.
3. 设计方案和技术路线
1.目的基因的选择
DNA条形码（DNA barcoding）是指通过对标准目的基因的DNA序列进行分析从而对相关物种进行鉴别，这种鉴别方法既简便亦很快速，近年来得到广泛的应用。起初加拿大生物学家Hebert等（Hebert et al,2003）利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（cytochrome C oxidase Ⅰ,COⅠ）这一目标基因序列鉴别同属一个种类的2500 多只哥斯达黎加普通蝴蝶并将其分成10个不同的组别，并由此发展出了DNA条形码技术来鉴别不同的物种。此后很多专家在此基础上发展出了通过其他目的基因来鉴别物种，例如利用D-loop基因序列鉴别麝属动物的鉴别（ Yang C,2014 ）,还有专家利用了线粒体基因 cytochrome b 进行物种鉴别（Naue J，2014）。因此选择四种目的基因（Cyt b，COI，D-loop）作为备选，在以后正式实验中进行筛选出效果最佳的一个。
2.DNA提取
4. 工作计划
1.文献分析结果
起初加拿大生物学家Hebert等（Hebert et al,2003）利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（cytochrome C oxidase Ⅰ,COⅠ）这一目标基因序列鉴别同属一个种类的2500 多只哥斯达黎加普通蝴蝶并将其分成10个不同的组别，并由此发展出了DNA条形码技术来鉴别不同的物种。此后很多专家在此基础上发展出了通过其他目的基因来鉴别物种，例如利用D-loop基因序列鉴别麝属动物的鉴别（ Yang C,2022 ）,还有专家利用了线粒体基因 cytochrome b 进行物种鉴别（Naue J，2022）。因此选择四种目的基因（Cyt b，COI，D-loop）作为备选，在以后正式实验中进行筛选出效果最佳的一个。
2.实验时间安排
5. 难点与创新点
1.DNA条形码（DNA barcoding）是指通过对标准目的基因的DNA序列进行分析从而对相关物种进行鉴别，这种鉴别方法既简便亦很快速，近年来得到广泛的应用。这项技术应用广泛，基本应用在动植物的鉴别中，在家禽尤其是关系到群众息息相关的食品安全方面还未及时应用到此项新兴技术。
2.QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System，QPCR具有高效、便捷、无毒等诸多优点，避免了检测人员接触凝胶电泳中的核酸染色剂（强致癌）。能在很短的时间内甄别样品的真假，为食品安全中的鉴别技术添砖加瓦并且对我国家禽的生物多样性增加一种快速鉴别手段。以上是毕业论文开题报告，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
